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1、用RAPD標(biāo)記研究苧麻屬植物的親緣關(guān)系 摘要：采用改良ＣＴＡＢ法提取了１３份苧麻屬材料的基因組ＤＮＡ，利用ＲＡＰＤ進(jìn)行親緣關(guān)系分析。從１２０條隨機(jī)引物中篩選出了２３條引物，對(duì)１３份材料共擴(kuò)增出２３５個(gè)條帶。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，得到反映各材料間親緣關(guān)系的樹狀圖。ＲＡＰＤ的分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)的分類結(jié)果基本相符。 關(guān)鍵詞：苧麻；親緣關(guān)系；ＲＡＰＤ 中圖分類號(hào)：Ｓ５６３．１；Ｑ７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８11407－1499-03 GeneticRelationshipamongB
2、oehmeriaspp.RevealedbyRAPD ?。眩桑眨茫幔椋螅瑁澹睿纾茫龋牛危牵茫瑁幔铮瑁酰?，ＺＨＡＯＬｉ－ｎｉｎｇ，ＬＩＹｕ－ｊｕｎ，ＺＡＮＧＧｏｎｇ－ｇｕ Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｌｅａｖｅｓｏｆＢｏｅｈｍｅｒｉａｓｐｐ．ｂｙｉｍｐｒｏｖｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆ１３Ｂｏｅｈｍｅｒｉａｓｐｐ．ｂｙｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ．
3、２３５ｂａｎｄｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙ２３ｐｒｉｍｅｒｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ１２０ａｒｂｉｔｒａｒｙｐｒｉｍｅｒｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ；ａｎｄｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｓｈｏｗｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｎｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｍｐｌｉｆｙｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ．Ｔｈｉｓｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｌ
4、ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ. ?。耍澹鳎铮颍洌螅海拢铮澹瑁恚澹颍椋醩pp.；ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ；ＲＡＰＤ 我國(guó)是苧麻的發(fā)源地，擁有最豐富的苧麻種質(zhì)資源。國(guó)內(nèi)的科技人員在苧麻資源的搜集、整理、評(píng)價(jià)方面做了大量工作。 在植物分類學(xué)方面，王文采［１］通過形態(tài)學(xué)分析對(duì)我國(guó)苧麻屬的３２種１１變種進(jìn)行了比較全面的描述；臧鞏固［２］通過核型分析討論了苧麻屬五組間的進(jìn)化關(guān)系。但是形態(tài)學(xué)分析和核型分析都有一定的局限性，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行更加準(zhǔn)確客觀地分類鑒定和
5、親緣關(guān)系分析成為可能?！ ”狙芯恳栽耘喾N苧麻“圓葉青”和其他１２份野生苧麻為試驗(yàn)材料，利用ＲＡＰＤ技術(shù)分析它們之間的親緣關(guān)系，同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)分類學(xué)分類方法驗(yàn)證其分析結(jié)果的可靠性，為分子標(biāo)記技術(shù)在苧麻屬植物的鑒定分類及種間親緣關(guān)系上的分析應(yīng)用提供了依據(jù)?！ 。辈牧吓c方法 ?。保辈牧稀 。保撤萜r麻材料見表１，均取自國(guó)家種質(zhì)長(zhǎng)沙苧麻圃?！ 。保卜椒ā 。保玻被蚪MＤＮＡ的提取與檢測(cè)ＤＮＡ提取采用改良ＣＴＡＢ法［３，４］并加以改進(jìn)。取１３份苧麻屬材料的幼嫩葉片提取基因組ＤＮＡ。稀釋一定倍數(shù)后，應(yīng)用紫外－可見
6、分光光度計(jì)檢測(cè)其在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ的吸光值，以測(cè)定ＤＮＡ濃度、評(píng)估其純度?！ 。保玻玻遥粒校姆磻?yīng)體系的優(yōu)化參照鐘軍［５］、任春曉［６］的方法并對(duì)影響ＰＣＲ反應(yīng)的各影響因子逐一進(jìn)行梯度優(yōu)化，包括模板ＤＮＡ用量、Ｍｇ２＋濃度、Ｔａｑ酶用量、ｄＮＴＰｓ濃度、退火溫度、引物濃度、ＰＣＲ條件等，建立起適合本實(shí)驗(yàn)的ＲＡＰＤ反應(yīng)體系?！ 。保玻常遥粒校臄U(kuò)增、電泳以提取的１３種基因組ＤＮＡ為模板，根據(jù)優(yōu)化后的ＲＡＰＤ反應(yīng)體系，用１２０條ＲＡＰＤ引物分別進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度２
7、％。ＥＢ染色后使用凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察記錄。 ?。保玻磾?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及遺傳多樣性分析選擇清晰且多態(tài)性較高的擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，相同位置有條帶的記為“１”，無條帶的記為“０”，失敗或缺失的記為“９”。基于擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用ＮＴＳＹＳｐｃ－２．１０ｅ軟件計(jì)算相似系數(shù)，以獲得１３份材料的遺傳相似系數(shù)矩陣，進(jìn)而采用ＵＰＧＭＡ法進(jìn)行聚類分析，以獲得遺傳樹狀圖譜并進(jìn)行分析?！ 。步Y(jié)果與分析 ?。玻被蚪MＤＮＡ提取結(jié)果 野生苧麻的含糖量很高，從其中提取高質(zhì)量的基因組ＤＮＡ具有一定困難。通過改良的ＣＴＡＢ法從野生苧麻
8、葉片中提取的基因組ＤＮＡ，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，ＤＮＡＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值為１．８～２．０，０．８％的瓊脂糖凝膠電泳顯示，所提取的基因組ＤＮＡ顯示為一條相對(duì)清晰完整的帶，大小在１９ｋｂ左右，無明顯降解痕跡，也沒有可見的ＲＮＡ。說明本實(shí)驗(yàn)所提取的苧麻基因組ＤＮＡ純度較高、質(zhì)量好，符合ＲＡＰＤ實(shí)驗(yàn)要求?！ 。玻搀w系優(yōu)化結(jié)果 通過對(duì)各成分進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)對(duì)比得到了較好的ＲＡＰＤ擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件，優(yōu)化后各成分最佳用量如表２，擴(kuò)
