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1、雙液相系統(tǒng)中分枝桿菌降解植物甾醇為雄烯二酮的工藝優(yōu)化柏挺上海新華聯(lián)制藥有限公司上海I摘要l雄烯二酮(AD)是制備甾體激素類藥物不可替代的中間體。本1．3．4轉(zhuǎn)化率計算方法文在基于15Ld、試發(fā)酵規(guī)模上，優(yōu)化大豆油／水雙液相系統(tǒng)中分枝桿茵降發(fā)酵完成后，取2ml發(fā)酵液以體積比l：功口入乙酸乙酯萃取，取上清解植物甾醇為雄烯二酮(AD)的工藝。研究了大豆油在發(fā)酵液中的最佳比例，液稀釋100倍，進(jìn)高效液相色譜儀。色譜條件：Symetry@C18柱，流動植物甾醇的投料量以及添加表面活性劑對提高植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響，得相甲醇：水=65：35，
2、流速1．0ml／min，柱溫3O℃，檢測波長240nm，進(jìn)到最佳轉(zhuǎn)化工藝條件：大豆油20％，投料量1．5％，添加0．2％吐溫-80，轉(zhuǎn)化樣量20L。96h，植物甾醇最終轉(zhuǎn)化率為87．5％。轉(zhuǎn)化率計算：【關(guān)鍵詞】雙相系統(tǒng)；分枝桿菌；雄烯二酮；植物甾醇；表面活性劑靴率=麗舢％雄甾-4-烯一3，l7-二酮(andr0s卜4一ene一3，17-dione，簡稱AD)，是制造甾體激素類藥物合成的關(guān)鍵中間物質(zhì)之一，幾乎所有的甾體激素0．97一甾醇純度0．66一AD與甾醇摩爾質(zhì)量比藥物都是以AD作為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)的n】。目前國內(nèi)主要從野生中
3、藥二，結(jié)果與分析材“穿地龍”等植物中提取薯蕷皂苷元后經(jīng)化學(xué)合成而成，工藝十分復(fù)2．1不同比例的大豆油對甾醇轉(zhuǎn)化率的影響雜，成本很高，而且污染環(huán)境大豆油對甾醇及AD均有較好的溶解性，在增加底物濃度的同時微生物降解甾醇的工作開始于20世紀(jì)60年代，已發(fā)現(xiàn)多種微生物對細(xì)胞的毒性又較小，而單純的提高大豆油比例也會破壞油／水雙相可將植物甾醇側(cè)鏈選擇性的切除得~I]AD。微生物法生產(chǎn)AD主要受甾平衡，影響細(xì)胞的生長代謝，同時也會造成生產(chǎn)上的浪費(fèi)生產(chǎn)成本的增醇在水中溶解度低的限制，甾醇在水中的溶解度低于2mg／L，產(chǎn)物AD加。根據(jù)文獻(xiàn)及相關(guān)試
4、驗摸索，如表1所示，大豆油含量20％左右，甾醇在水中的溶解度也不高zJZ50mg／L“，甾體化合物的難溶性是限制微生轉(zhuǎn)化率較高。物轉(zhuǎn)化工業(yè)化最主要的障礙之一。傳統(tǒng)的單水相發(fā)酵多采用添加少量I表1大豆油／Tk雙相系統(tǒng)下甾醇轉(zhuǎn)化率l有機(jī)溶劑、表面活性劑的方法來提高甾醇在發(fā)酵液中的溶解度，效果并不理想，而且有機(jī)溶劑等對細(xì)胞產(chǎn)生毒性以及對安全、環(huán)保等因素影l(fā)AD轉(zhuǎn)化率％122．8J70．5182．1174．9168．4l響，從而制約了其在工業(yè)化上的應(yīng)用。采用大豆油／Tk雙液相發(fā)酵系統(tǒng)，2．2不同投料量對甾醇轉(zhuǎn)化率的影響可以有效增加甾醇的
5、溶解度，提高底物投料量，而且減少了對細(xì)胞的毒甾醇是一種疏水性化合物，難溶于水，過量底物難以被大豆油溶解性。本文主要研究了大豆油在發(fā)酵液中所占比例，植物甾醇的投料量以分散，且會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，不利于轉(zhuǎn)化率的提高，從而對原料造成浪及添加表面活性劑對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響。費(fèi)。在大豆油／水雙相發(fā)酵系統(tǒng)中，隨著甾醇投料量的增加，轉(zhuǎn)化率上升一．材料與方法到一定水平后呈下降趨勢。當(dāng)投料濃度達(dá)到1．5％時轉(zhuǎn)化率可達(dá)到85％左1．1材料右，繼續(xù)提高甾醇投量至2％轉(zhuǎn)化率下降至80％以下。1．1．1菌種2．3不同比例吐溫一80對甾醇轉(zhuǎn)化率的影響分枝桿
6、菌MycobacteriumspHL一501(上海新華聯(lián)制藥有限公表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜相似，在微生物轉(zhuǎn)化過程中，它可司菌種室保藏)。以增加底物的溶解度，同時改變細(xì)胞膜的通透性。吐溫80是一種常見的1．1．2試劑水包油型表面活性劑，試驗證明在大豆油／水雙相發(fā)酵培養(yǎng)基中添加吐甾醇為進(jìn)口甾醇，大豆油購于上海良友海獅油脂實業(yè)有限公司，吐溫80可有效提高甾醇轉(zhuǎn)化率，投量為0．2％時，轉(zhuǎn)化率可達(dá)N85％左右。溫8O購于上海申宇醫(yī)藥化工有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。低于該濃度，其對甾醇的溶解能力及對細(xì)胞膜通透性影響較小，而高于1．
7、1．3培養(yǎng)基該濃度，則破壞細(xì)胞膜通透性，轉(zhuǎn)化率均不能達(dá)到理想水平。斜面培養(yǎng)基(g／L)：牛肉膏5；胰蛋白胨l0；葡萄糖25；瓊J]~20，滅2．4正交試驗菌后pH6．8-7．2。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇大豆油投料濃度，底物甾醇投料濃度種子培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖8；玉米漿65，酵母膏4；NaN05，和吐溫80投料濃度3因素，以AD轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，設(shè)計L。(3)正交(NH4)2HPO40．5，滅菌后pH6．8-7．2。試驗，正交試驗設(shè)計及極差分析見表2，方差分析見表3。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g／L)：大豆油200；甾醇15；玉米漿65；酵
8、母膏4；表2正交試驗設(shè)計及極差分析NaNO35}(NH4)2HPO40．5，吐溫80l_5，滅菌后pH6．8—7．2。試驗號A(大豆油B(甾醇濃C(吐溫80空列轉(zhuǎn)化率％1．2儀器設(shè)備濃度)％度)％濃度)％美國安捷倫1260高效液相色譜儀；上海國強(qiáng)生物工程有限公司
