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《菜油甾醇和孕烯醇酮在耶氏解脂酵母中的合成與優(yōu)化》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、菜油甾醇和孕烯醇酮在耶氏解脂酵母中的合成與優(yōu)化DenovosynthesisandoptimizationofcampesterolandpregnenoloneinYarrowialipolytica學(xué)科專業(yè):生物化工作者姓名:張羽指導(dǎo)教師:元英進(jìn)教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一七年五月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果,除了文中特別加以標(biāo)注和致謝之處外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得天津大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同
2、工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名:簽字日期:年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。特授權(quán)天津大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說明)學(xué)位論文作者簽名:導(dǎo)師簽名:簽字日期:年月日簽字日期:年月日摘要菜油甾醇和孕烯醇酮是異源合成甾體激素類藥物的重要前
3、體及中間體。本文擬在耶氏解脂酵母中引入異源菜油甾醇和孕烯醇酮合成路徑,并通過異源蛋白來源篩選、競爭性路徑敲除、乙酰CoA來源與分配優(yōu)化,蛋白截短和重定位等策略,以期在耶氏解脂酵母中實(shí)現(xiàn)菜油甾醇和孕烯醇酮的高水平表達(dá)。菜油甾醇在耶氏解脂酵母中合成需引入異源關(guān)鍵酶—7脫氫膽固醇還原酶(DHCR7),本研究對6種DHCR7來源進(jìn)行篩選獲得DHCR7最佳來源—斑馬魚(Daniorerio),通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)D409E、G408P及L404F(L404M)是影響酶活性的三個關(guān)鍵突變點(diǎn),其中D409E突變使非洲爪蟾(Xe
4、nopuslaevis)來源DHCR7酶活下降86%。通過敲除麥角固醇路徑酶ERG5,并導(dǎo)入斑馬魚(Daniorerio)來源DHCR7,獲得僅積累菜油甾醇的高產(chǎn)菌株SyBE_Yl02060056,其搖瓶水平產(chǎn)量是報(bào)道最高產(chǎn)量的1.38倍。以該菌株為底盤,在葡萄糖和葵花籽油兩種碳源下表征13種乙酰CoA合成與分配相關(guān)基因?qū)Σ擞顽薮嫉恼{(diào)控作用,得出以葵花籽油為碳源時的3個關(guān)鍵代謝調(diào)控靶點(diǎn)HMGR、ACL和POX2,這三個靶點(diǎn)分別使菜油甾醇產(chǎn)量提高1.32、1.22和1.19倍。在5-L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化獲得菜油
5、甾醇最高產(chǎn)量941.5mg/L,為目前已知最高產(chǎn)量。孕烯醇酮在耶氏解脂酵母菌株中以菜油甾醇為前體經(jīng)P450scc系統(tǒng)(包括CYP11A1、AdR和AdX)催化合成。對36種不同來源P450scc組合進(jìn)行篩選,首次實(shí)現(xiàn)孕烯醇酮在耶氏解脂酵母中的全合成,并獲得最佳組合野豬(Susscrofa)來源CYP11A1及牛(Bostaurus)源AdR和AdX。探究影響孕烯醇酮合成的因素,包括底物特異性、前體菜油甾醇存在形式、前體與酶接觸及酶活性等,發(fā)現(xiàn)前體與酶空間位置隔離及酶活性不足是導(dǎo)致孕烯醇酮產(chǎn)量較低的關(guān)鍵。通過選用強(qiáng)啟
6、動子并將野豬(Susscrofa)來源CYP11A1重定位于脂質(zhì)體膜上,使孕烯醇酮產(chǎn)量達(dá)到3.1±0.5mg/L,提高了13倍。本研究采用多種策略對耶氏解脂酵母中菜油甾醇和孕烯醇酮的合成進(jìn)行優(yōu)化,為其他萜烯類物質(zhì)產(chǎn)量提升提供多種有效優(yōu)化方式,同時為其他微生物高產(chǎn)萜烯類物質(zhì)提供借鑒意義。另外本實(shí)驗(yàn)獲得的菜油甾醇及孕烯醇酮高產(chǎn)菌株可供后續(xù)甾體激素類產(chǎn)物的進(jìn)一步合成。關(guān)鍵詞:甾體激素藥物,菜油甾醇,孕烯醇酮,合成生物學(xué),耶氏解脂酵母,產(chǎn)量優(yōu)化IIIABSTRACTCampesterolandpregnenoloneare
7、importantprecursorandintermediatetoheterologoussyntheticsteroiddrugs.ThisstudyplanedtointroduceheterologouscampesterolandpregnenolonesynthesispathwaysinYarrowialipolytica,andcarryoutavarietyofoptimizationstrategies,includingscreeningheterologousproteinsource,k
8、nockingoutcompetitivepathway,optimizingacetyl-CoAsupplementanddistributionandtruncatingorredirectingenzyme,hopingtoachievehigh-levelexpressionofcampesterolandpregnenoloneinYarrowia