資源描述:
《牛血中SOD的分離純化步驟.doc》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、1.前言超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD,ECl.15.1.1)廣泛存在于動物、植物和微生物中,是一種能專一地清除超氧陰離子自由基(O—2)的金屬酶[1]。按所含金屬離子不同可分為Cu—Zn—SOD、Mn—SOD和Fe—SOD[2]。SOD催化反應(yīng):2H++2O—2→2H2O2+O2。SOD對過量的O—2的及時清除保證了機體內(nèi)O—2的含量相對平衡,對機體起防護作用[3]。國內(nèi)外研究表明SOD具有抗炎、抗衰老抗輻射[4]等重要作用[5]。我國近年來在植物SOD的研究領(lǐng)域有大量相關(guān)進展報道。許平[6]、袁藝[7]、趙文芝[8]、余旭亞[9]等分別從大蒜
2、、桑葉、沙棘、仙人掌中提取出SOD并進行相關(guān)研究。SOD的制備方法隨原料而異,目前國內(nèi)外制備SOD的原料有動物血[10]、微生物和動植物組織。牛血通常不會進行再加工,本文旨在通過牛血中SOD的研究,為牛血SOD的開發(fā)利用提供依據(jù)。2.材料與方法2.1材料2.1.1儀器50ml離心管,500ml燒杯,200ml燒杯,電子天平,冷凍離心機,試管,恒溫水浴鍋,紫外分光光度計,電泳儀,垂直電泳槽,培養(yǎng)皿(染色用),移液器(1000ul、100ul、50ul、10ul),YC-1層析柜,混合器,恒流泵,紫外檢測儀,自動收集裝置,記錄儀等。2.1.2材料新鮮牛血(購于北京市牛街),Seph
3、adexG-100凝膠2.1.3試劑(1)磷酸緩沖液(pH7.6、2.5mmol/L)(2)考馬斯亮藍G-250試劑:稱取100mg考馬斯亮藍G-250,溶于50ml95%乙醇中,加入100ml85%的磷酸,蒸餾水定容至1000ml。此試劑常溫下可保存30天。(3)標準蛋白(BSA)標準蛋白質(zhì)溶液:精確稱取結(jié)晶牛血清白蛋白25mg,加蒸餾水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml,用蒸餾水稀釋至100ml,即為100ug/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。(4)SOD活力測定試劑①50mmol/LpH8.2Tris—HCl緩沖液(Tris0.61g,EDTA—Na20.037g,0.1
4、mol/LHCl調(diào)PH8.20,定容至100ml);②45mmol/L鄰苯三酚溶液(用10mmol/L鹽酸配制)。③10mmol/L鹽酸。(1)40%蔗糖:稱取40g蔗糖加重蒸水100ml。(2)10%過硫酸銨(AP):稱過硫酸銨10g,溶于100ml重蒸水中。用時現(xiàn)配。(3)電極緩沖液:稱取Tris(三羥甲基氨基甲烷)6g,甘氨酸28.8g。用蒸餾水溶解并定容至1000ml。用時稀釋10倍。(4)膠貯液(30%的Acr/Bis溶液):稱丙烯酰胺Acr29.1g,甲叉雙丙烯酰胺Bis0.9g,加重蒸水溶解,定容至100ml,過濾后裝入棕色瓶,4℃保存。(5)分離膠緩沖液:Tri
5、s(三羥甲基氨基甲烷)36.6g,加1mol/LHCl48ml,用濃鹽酸調(diào)pH8.9,再用蒸餾水定容至100ml。(6)濃縮膠緩沖液:Tris6.0g,加1mol/LHCl48ml,TEMED0.4ml,用濃鹽酸調(diào)至pH6.8后,再用蒸餾水定容至100ml。(7)脫色液:乙酸。(8)TEMED2.2方法2.2.1收集紅細胞、溶血取加入抗凝劑的新鮮牛血300ml,充分搖勻,3000r/min離心20min除去血漿,收集沉淀(紅細胞),加入等體積0.9%NaCl溶液,用玻璃棒攪起充分洗滌,3000r/min離心20min,棄去上清液(重復(fù)3次,上層液體為淡黃色),收集洗凈的沉淀(紅
6、細胞)放入500ml燒杯中,加入等體積ddH2O,將燒杯置于冰浴中攪拌溶血30min,得溶血液約200ml,放入YC-1層析柜中(0~4℃)過夜,使紅血球充分破裂。2.2.2沉淀血紅蛋白向溶血液中加入4℃下預(yù)冷的95%乙醇(0.25倍體積,50ml),然后再緩慢加入4℃下預(yù)冷的氯仿(0.15倍體積,30ml),攪拌45min,靜置2h,冷凍3500r/min離心20min,棄去沉淀(血紅蛋白),收集上清液85ml,此即酶的粗提液。上清繼續(xù)冷凍3500r/min離心20min。2.2.3SOD富集向酶粗提液加入35gK2HPO4?3H2O(按43gK2HPO4?3H2O:100m
7、l粗提液的比例),充分攪勻,轉(zhuǎn)移到分液漏斗,震搖后靜置15min,見明顯分層。收集含SOD上層乙醇-氯仿相(微渾濁,42ml),室溫下3500r/min離心25min,棄去沉淀,得上清液約40.5ml。2.2.4SOD純化2.2.4.1沉淀。在上清液中加入等體積4℃預(yù)冷的丙酮40ml,攪拌均勻,YC-1層析柜中靜置20min,3500r/min離心20min收集沉淀物。2.2.4.2溶解。向沉淀中加入少量去離子水溶解,4500r/min離心20min,合并兩次上清,共23ml。2.2.4.3