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1、銅鋅SOD的分離純化與活性鑒定【實驗導讀】蛋口質的提取分離技術是化學牛物序研究者應該熟練掌握的重點技術之一。蛋白質的純化步驟應根據(jù)純化蛋白的具體性質來設計?？梢岳玫降男再|包括蛋白質的分了量人小、蛋白質的等電點、對冇機溶劑的耐受性、對溫度的耐受性、中性無機鹽對蛋白質溶解性的影響等等。為了保證蛋白質提取分離純化的成功，需耍在整個實驗過程中，對所得蛋白質的總量和活性進行不斷監(jiān)測。SOD是超氧化物歧化酶的簡稱，是一個典型的腮類蛋白質。它催化超氧化物的歧化反應，是真核生物細胞內抗氧化酶系的重耍組成部分。它能夠耐受相對較高的溫度、對有機溶劑丙酮和氯仿-乙醇也具有較好的耐受性。利用這些
2、性質，木實驗通過一些列實驗流程達到了對大蒜SOD進行初步純化的目的。每經(jīng)過一個純化步驟，本實驗都將監(jiān)測所得產(chǎn)物的總蛋白量以及總SOD活性，并計算SODiW在總蛋白屮的比活力(總SOD活性與總蛋白量之比)。如果分離純化過程是成功的，則總蛋白量應不斷下降，而SOD酶的比活力應不斷上升。通過本實驗的訓練，讀者應該能夠初步掌握蛋口質的純化流程，根據(jù)所給蛋白質的理化性質設計出一?套比較合理的蛋口質純化方案。一、實驗目的1.進一步熟悉掌握分光光度計的使用方.2.熟悉SOD提収與分離的基本原理與操作方法，學習一般蛋白質純化的基本流程.3.掌握考馬斯亮藍染色法測定蛋口質含量的基本原理與操作
3、.4.了解SOD活力測定一鄰苯三酚法的原理.二、基本原理對于以氧氣作為呼吸作用最終電子受體的生物來說，除將氧氣還原為其完全還原產(chǎn)物水以外，還有可能產(chǎn)牛包括超氧負離子(0Q在內的一系列不完全還原產(chǎn)物，這類分子統(tǒng)稱為活性氧族(reactiveoxygenspecies,ROS)。ROS具有極強的化學反應活性，「】J以與蛋白質、脂類、核酸等生物人分了發(fā)生反應并破壞它們的結構與生物學功能。ROS在細胞內聚集將對細胞的正常住命活動造成不良后果。為了應對這一潛在的嚴峻挑戰(zhàn)，細胞內形成了一套有效的ROS清除系統(tǒng)。超氧化物歧化K(superoxidedismutase,SOD)是細胞內RO
4、S清除系統(tǒng)的重要組分Z-oSOD廣泛存在于動植物及微生物體內，可催化細胞內超氧負離了(01)的歧化反應，將02轉化為山02和0“因此，SOD具有強烈的抗氧化活性，在化妝品、食品、醫(yī)藥等領域具有十分廣闊的應用両景。本實驗介紹的是一種SOD初步純化方法。SOD是一種多聚體金屬蛋白，根據(jù)酶活性中心所盂金屬輔某的不同，可將SOD進一步分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Ni-S0D4種，這四種不同的SOD分別由不同的基因編碼。無論是在原核還是真核牛?物當中，SOD基因的表達都處于體內外各種因素的嚴密調控之下。原核生物SOD基因的表達調控主要受其生長營養(yǎng)條件以及所處壞
5、境的影響。而在真核生物細胞內，SOD基因的表達調控則與動植物的生長發(fā)冇階段與體內各種激素水平有關⑷。Cu/Zn-SOD主要存在于真核住物與細菌的細胞質中。在細菌、植物和動物屮，Cu/Zn-SOD的編碼基因序列保守性較低，這可能與不同生物適應環(huán)境的機制不盡相同有XoMn-SOD主要存在于原核生物和真核生物的線粒體中。FeSOD存在于原核生物和少數(shù)植物中，在原核生物和植物葉綠體屮編碼l^e-SOD的基因序列相似性很高⑵。Ni-SOD的發(fā)現(xiàn)則相對較晚，主要存在于一些低等生物中，在植物中尚沒有被發(fā)現(xiàn)⑶。天然存在的這些SOD,雖然活性屮心所需的金屬離子不同，但催化活性部位卻具有高度的
6、結構同一性和進化的保守性。即活性小心金屬離子都是與3到4個組氨酸(His)殘基的咪喘基(血-SOD含1個天門冬氨酸竣基配位)呈畸變的四方錐或扭曲的四面體配位。三種SOD的主要性質比較見下表。三種SOD的主要理化性質比較Cu/Zn-SODMn-SODFe-SOD分子結構一或四聚體一或四聚體一或四聚體分子量32000,6500042000,8500042000,85000每個亞棊金屬含量1Cu:1Zn0.5~lMn0.5~lFe顏色藍綠色紫紅色黃褐色特征吸收峰260nm,680nm280nm,475nm280nm分子構象主要為B-折疊主要為?-螺旋主要為a-螺旋抑制劑CN、II
7、202氯仿-乙醇氯仿■乙醇、H202Cu/Zn-SOD是分布最廣而且是最重要的SOD,主要存在于真核細胞的細胞漿內，分子量約為32KD,通常情況下由兩個亞基組成。Cu/Zn-SOD對熱、pH以及某些比較極端的理化因素具有有較強的耐受性。比如，即使經(jīng)60°C短時間處理后酶的活性幾乎無損失；同時，酶活性不受冇機溶劑乙醇和氯仿影響。大蒜蒜瓣內含冇較豐富的Cu/ZnSOD,通過組織破碎后,可溶解于PH7.8磷酸緩沖液中。由于該酚不溶于丙酮,可用丙酮將其沉淀析IIIoCu/Zn-SOD對氯仿-乙醇混合液不敏感，即使用這種混合
