Western Blot 原理和操作方法(詳細(xì)).doc

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1、.WesternBlot原理和操作方法（詳細(xì)）$5V?工作原理Y

2、-_2IU??蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用.-O{`?'Q%9v?SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,

3、特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量.}~<+{sQ?PAGE能有效的分離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異,因?yàn)镾DS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT),其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級及三級結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu),電泳樣品假如樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與

4、蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時,蛋白質(zhì)分子的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質(zhì)也完全變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子,這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來所帶的電荷可以忽略不計,消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小,這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.TIZO4Jz?樣品處理液常加入溴酚藍(lán)染料,溴酚藍(lán)指示劑是一個較小的分子,可以

5、自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時,即可停止電泳.&$?>&A?另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.?T&ZpP_]?重要參數(shù)(iLo=fd78?..①聚丙烯酰胺凝膠(PAG)制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C)決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個參數(shù).一般可以由下述公式計算:2`l#6?T%=(a+b)/m*100%;和C%=a/(a+b)*100%&]*xjs{?其中:a=雙體(bis)的重量;b=

6、單體(arc)的重量;m=溶液的體積(ml)uUo!k`lH?L0#p36e?②當(dāng)分析一個未知樣品時,常常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗(yàn),以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度:RKB6&r5k?2OJxL"mEc?蛋白質(zhì)分子量圍(Da)適宜的凝膠濃度(%)rQ9+x6?<10420-30"(pga?1×104-4×10415-20tuv7?0:{F?4×104-1×10510-15ywj"?>5×1052-5LpS)D:xN?_#28fOo?

7、③分離膠:N%<k[4?電泳凝膠濃度hR7z

8、dx*?試劑10%12%15%10%12%15%G9,r}$E?H2O(ml)4.03.32.35.94.93.4zHVI2w?30%丙烯酰胺(T:30%,C:3%(ml)3.34.05.05.06.07.5ngl88w?1.5mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)2.52.52.53.83.83.8Dj'3*=5?10%SDS(ml)0.10.10.10.150.150.155HHU.kmp?10%AP(ml)0.10.10.10.150.150.15{t'9tNki?TEMED(μl)44466

9、6z!bT*`E