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1、工程菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的氮源選擇與過(guò)程調(diào)控陳寧天津科技大學(xué)代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室基因工程菌的發(fā)酵工程菌的來(lái)源1工程菌的應(yīng)用2工程菌的培養(yǎng)3氨基酸發(fā)酵的氮源選擇4一、工程菌的來(lái)源基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類(lèi)似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類(lèi)型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代基因工程基因工程的核心技術(shù)是DNA的重組技術(shù)。重組即利用供體生物的遺傳物質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過(guò)體外或離體的限
2、制酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來(lái)形成重組DNA分子，然后在將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類(lèi)事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀除DNA重組技術(shù)外，基因工程還應(yīng)包括基因的表達(dá)技術(shù)、基因的突變技術(shù)、基因的導(dǎo)入技術(shù)等基因工程一、工程菌的來(lái)源表達(dá)載體基因載體是一類(lèi)能自我復(fù)制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影響其復(fù)制，可用以置換或插入外源(目的)DNA而將目的DNA帶入宿主細(xì)胞，常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒外源基因插入載體中，使其處于一系列的表達(dá)信號(hào)的控制之下。這樣基因可以轉(zhuǎn)錄和表達(dá)?？寺≥d
3、體提供了表達(dá)的信號(hào)，所以可以用來(lái)生產(chǎn)重組蛋白，被稱(chēng)為表達(dá)載體一、工程菌的來(lái)源質(zhì)粒質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因一、工程菌的來(lái)源目的基因的獲得載體的選擇與制備目的基因與載體連接成重組體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞重組菌的篩選及目的基因的表達(dá)構(gòu)建步驟一、工程菌的來(lái)源構(gòu)建步驟一、工程菌的來(lái)源蘇氨酸基因工程菌構(gòu)建策略二、工程菌的應(yīng)用就生產(chǎn)流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物，工程菌和常規(guī)微生物并無(wú)太多的差異。但工程
4、菌在保存過(guò)程中及發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問(wèn)題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點(diǎn)三、工程菌的培養(yǎng)基因工程細(xì)胞工業(yè)化培養(yǎng)中，產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)規(guī)模為低。其原因主要與基因工程細(xì)胞特點(diǎn)有關(guān)，首先基因工程細(xì)胞的生長(zhǎng)速率及表達(dá)率與其所載外源DNA的穩(wěn)定性及產(chǎn)物分泌過(guò)程有關(guān)，其中重組DNA的穩(wěn)定性尤為重要基因工程細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，重組DNA的丟失方式亦有兩種，其一是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，由于回復(fù)突變或分配作用致使DNA丟失，稱(chēng)為脫落性不穩(wěn)定，其二是重組DNA中編碼的結(jié)構(gòu)基因在宿主內(nèi)發(fā)生再重組過(guò)程產(chǎn)生突變，不再表達(dá)目的產(chǎn)物，稱(chēng)為結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)
5、定培養(yǎng)特點(diǎn)三、工程菌的培養(yǎng)質(zhì)粒穩(wěn)定性三、工程菌的培養(yǎng)在重組菌工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，質(zhì)粒的不穩(wěn)定性是一個(gè)極為重要而獨(dú)特的問(wèn)題。帶有質(zhì)粒的細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，生長(zhǎng)速率與所帶質(zhì)粒的大小成反比。此外，高水平克隆基因產(chǎn)物的生成也會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢或生長(zhǎng)異常（表達(dá)越高，生長(zhǎng)越慢）。由于質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，在繁殖傳代過(guò)程中還會(huì)有一部分細(xì)胞部分甚至完全丟失質(zhì)粒，導(dǎo)致所需產(chǎn)物的產(chǎn)量下降分離性不穩(wěn)定：這是由于在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)粒缺失分配到子細(xì)胞中而導(dǎo)致整個(gè)質(zhì)粒丟失結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定：這是由于重組質(zhì)粒DNA發(fā)生缺失、插入或重排引起的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化質(zhì)粒穩(wěn)定性三、工程菌的培養(yǎng)使質(zhì)粒穩(wěn)定的措施
6、組建合適載體選擇適當(dāng)宿主施加選擇壓力抗生素添加法抗生素依賴變異法營(yíng)養(yǎng)缺陷型法控制基因過(guò)量表達(dá)控制培養(yǎng)條件（溫度、pH、DO）控制培養(yǎng)條件三、工程菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成：不同的培養(yǎng)基能影響微生物的代謝活動(dòng)，也能影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。質(zhì)粒在豐富培養(yǎng)基中比在最低限量培養(yǎng)基中更加不穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：含有重組質(zhì)粒的克隆菌的比生長(zhǎng)速率往往比受體菌要小，同樣質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌后會(huì)使受體菌的生長(zhǎng)溫度改變。通常而言，低溫有利于重組質(zhì)粒穩(wěn)定地遺傳控制培養(yǎng)條件三、工程菌的培養(yǎng)溶氧：攜帶質(zhì)粒的基因工程菌相對(duì)于野生菌增加了額外的代謝負(fù)擔(dān)，對(duì)氧需求量較大，發(fā)酵液中必須有足夠濃度的溶解
7、氧，才能滿足菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的需要過(guò)低的溶氧濃度則導(dǎo)致乙酸的大量生成，菌體生長(zhǎng)受到抑制，質(zhì)粒穩(wěn)定性差控制培養(yǎng)條件三、工程菌的培養(yǎng)菌體比生長(zhǎng)速率：比生長(zhǎng)速率對(duì)重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響結(jié)果不盡一致，并可能與克隆菌本身和培養(yǎng)條件有關(guān)。有時(shí)，比生長(zhǎng)速率大有利于重組質(zhì)粒穩(wěn)定地遺傳如果不含重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞不比含有重組質(zhì)粒的克隆菌生長(zhǎng)快，則重組質(zhì)粒的丟失就不會(huì)導(dǎo)致非常嚴(yán)重的后果。因此調(diào)整這兩種菌的比生長(zhǎng)速率可以提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，但這點(diǎn)往往難以達(dá)到，因?yàn)榇蠖鄶?shù)環(huán)境條件同時(shí)提高或降低這兩種菌的比生長(zhǎng)速率在某些情況下，可以利用分解代謝物效應(yīng)控制菌的比生長(zhǎng)速
8、率，來(lái)提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。如在重組質(zhì)粒中克隆入抗高濃度抑制的某個(gè)基因，這樣在進(jìn)行高濃度底物培養(yǎng)時(shí)，受體菌被抑制，比生長(zhǎng)速率下降，而重組菌仍能正常生長(zhǎng)三、工程菌的培養(yǎng)在基因工程細(xì)
