基因工程菌發(fā)酵ppt課件.ppt

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1、第五節(jié)基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為：分裂不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因常見分裂不穩(wěn)定的兩個因素：⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；⑵這兩種菌比數(shù)率差異的大小。對同一工程菌控制不同的比生長數(shù)率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高如增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性；高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低但對穩(wěn)定性不利。菌體生長數(shù)率對質(zhì)?？截悢?shù)和質(zhì)粒穩(wěn)定性有一影響。高生

2、長數(shù)率時質(zhì)粒拷貝數(shù)下降，但穩(wěn)定性增加。生長數(shù)率/h0.20.4質(zhì)?？截悢?shù)10.5×10950400β-半乳糖苷酶工程菌的連續(xù)養(yǎng)3質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法樣品不含抗性標記抗生素平板培養(yǎng)基10-12h100個菌落含抗性標記抗生素平板培養(yǎng)基10-12h統(tǒng)計生長菌落數(shù)重復(fù)三次,計算比值(穩(wěn)定性stability)二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：⑴先使菌體生長至一定密度；⑵再誘導(dǎo)外源基因的表達由于第一階段外源基因未表達，減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長速率的差別，增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性。在培養(yǎng)基中加入抗菌素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、

3、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋數(shù)率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。第六節(jié)基因工程菌生長代謝的特點菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長?？刂凭w的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變，都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的和成和菌體的生長。一、菌體的

4、生長與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細胞提供能量，當菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產(chǎn)生乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當提高pH，可減少乙酸的抑制作用分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作為宿組主細胞，阻止乙酸產(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，

5、蛋白合成增加?；蚬こ叹|(zhì)粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，致工程菌生長速率降低。質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴緊反應(yīng)”有關(guān)?！皣谰o反應(yīng)”是當氨酰tRNA不足時,核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點的ppGpp的結(jié)果。ppGpp是一個重要的調(diào)控分子。它通過影響RNA鏈的延深過程減少轉(zhuǎn)錄。它的濃度增加會導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時RNA聚合酶在模板上的移動產(chǎn)生停頓

6、，RNA鏈延長速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴緊控制的啟動子如rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。也可能ppGpp是通過干擾RNA聚合酶與PL啟動子專一識別反應(yīng)。第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過程包括:⑴通過搖瓶操作基因工程菌生長的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氧比，分析表達產(chǎn)物的合成、積累對受體細胞的影響;⑵通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。菌種一級種子搖瓶二級種子罐培養(yǎng)擴大培養(yǎng)原料發(fā)酵培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離基配制微生物工業(yè)發(fā)酵過程簡圖一、基因工程菌的培養(yǎng)方式基因工程菌的培養(yǎng)方式：補料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)。⒈補料分批培養(yǎng)補料分批

7、培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進行培養(yǎng),經(jīng)過一段時間后間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的方法。二、基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。工藝要求：外源基因既高效表達，又有利于產(chǎn)品分離純化。對發(fā)酵影響較大的幾個因素有：⒈培養(yǎng)基的影響⒉接種量的影響⒊溫度的影響⒋溶解氧的影響⒌誘導(dǎo)時機的影響⒍pH的影響⒈培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提