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1、植物組織中葉綠素含量測(cè)定（無(wú)機(jī)及分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)II-設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．設(shè)計(jì)用分光光度計(jì)測(cè)定植物組織中的葉綠素2.學(xué)習(xí)利用文獻(xiàn)資料設(shè)計(jì)研究方案3.掌握分光光度計(jì)測(cè)定植物組織中的葉綠素的原理與方法二、原理：葉綠素廣泛存在于果蔬等綠色植物組織中，并在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠體。當(dāng)植物細(xì)胞死亡后，葉綠素即游離出來(lái)，游離葉綠素很不穩(wěn)定，對(duì)光、熱較敏感；在酸性條件下，葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀堿液中可水解成鮮綠色的葉綠酸鹽以及葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種，均易溶于乙醇、乙醚、酒精和氯仿。葉綠素a葉綠素b葉
2、綠素a、b在長(zhǎng)波方面最大吸收峰分別位于663nm和645nm，且兩吸收曲線相交于652nm處。葉綠素a、b的比吸收系數(shù)K為已知，可在663nm和645nm測(cè)定試樣吸光度（兩組份混合試樣測(cè)定，雙波長(zhǎng)法），根據(jù)Lambert－Beer定律，列出濃度c與吸光度A之間的關(guān)系式：A663＝82.04ca＋9.27cb…………………………………（1）A645＝16.75ca＋45.6cb…………………………………（2）（1）、（2）式中的A663、A645為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm和645nm時(shí)的吸光度度。ca、cb為葉綠素a、b
3、的濃度，單位為g/L。82.04、9.27為葉綠素a、b在波長(zhǎng)663nm時(shí)的比吸收系數(shù)16.75、45.6為葉綠素a、b在波長(zhǎng)645nm時(shí)的比吸收系數(shù)。解方程式（1）（2），則得經(jīng)驗(yàn)公式：ca=12.7A663-2.69A645…………………………………（3）cb=22.9A645-4.68A663…………………………………（4）cT=（ca+cb）=20.2A645+8.02A663…………………（5）此時(shí)，cT為總?cè)~綠素濃度，ca、cb為葉綠素a、b的濃度，單位為mg/L，利用上面（3）（4）（5）式，即可以計(jì)算a、
4、b總?cè)~綠素的濃度。儀器：分光光度計(jì)、電子天平、棕色容量瓶（如使用白玻容量瓶，可用報(bào)紙遮光）、小漏斗、濾紙?jiān)噭?5%乙醇一、實(shí)驗(yàn)步驟1、試材的采集采集新鮮植株葉片（或含葉綠素的其他組織），夾于雙層報(bào)紙中，風(fēng)干（不能置于太陽(yáng)光下曬）。將風(fēng)干材料處理成細(xì)小顆粒，裝入封口塑料袋，避光保存。2、待測(cè)液的制備（1）葉綠素的浸提精密稱定風(fēng)干后的樣品（約0.1g）于20mL95%乙醇中，在室溫浸提36-48h。（2）葉綠素浸提液定容提取液過(guò)濾到50mL棕色容量瓶（如使用白玻容量瓶，可用報(bào)紙遮光），用95%乙醇定容至50mL，搖勻，置于
5、暗處備用待測(cè)。3、測(cè)量吸光度取1cm的比色皿，注入上述葉綠素酒精溶液，用95%乙醇為參比液，1cm的比色皿為吸收池，分別在663nm和645nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度，每一波長(zhǎng)讀三次數(shù)，取平均值帶入公式計(jì)算。如吸光度大于0.8，按倍數(shù)準(zhǔn)確稀釋（稀釋倍數(shù)為n），盡量使吸光度的測(cè)量值在0.2-0.8范圍內(nèi)。4、結(jié)果計(jì)算用測(cè)得的吸光度A663、A645，代入（3）式計(jì)算溶液中葉綠素a的含量；代入（4）式中計(jì)算得到葉綠素b的含量，代入（5）式計(jì)算得到葉綠素總含量。計(jì)算植株中葉綠素含量時(shí)，需要考慮稀釋因子。數(shù)據(jù)記錄及處理：表1波長(zhǎng)A1A2A
6、3A平均值663nmA663(平均值)=645nmA645(平均值)=表2cacbcTwT17周星期一、星期二（全天開(kāi)放）采集新鮮樹(shù)葉并把樣品帶到實(shí)驗(yàn)室來(lái)領(lǐng)塑料密封的試管，然后稱量0.1g新鮮樣品用研缽磨碎，并用少量酒精洗滌并轉(zhuǎn)移到塑料密封試管，稀釋到50mL的刻度，帶回家避光保存，并于星期三，星期四（全天開(kāi)放）帶到實(shí)驗(yàn)室測(cè)定吸光度，并計(jì)算濃度含量，交實(shí)驗(yàn)報(bào)告批改后登記成績(jī)。
