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《醛糖還原酶基因AR的克隆.doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、醛糖還原酶基因AR的克隆一、醛糖還原酶DNA模板的構(gòu)建抽取人體血液，經(jīng)過親和色譜法提取mRNA，該過程可用商業(yè)化的試劑盒分離系統(tǒng)，得到高純度mRNA。再用RT-PCR法，逆轉(zhuǎn)錄出c-DNA,再合成AR基因。二、引物設(shè)計(jì)登陸NCBI網(wǎng)站，進(jìn)入“核酸”中，輸入醛糖還原酶的登陸碼：U37100，找到該序列：1CAAAAACAGCAACAGAAAGCAGGACGTGAGACTTCTACCTGCTCACTCAGAATCATTTCT61GCACCAACCATGGCCACGTTTGTGGAGCTCAGTACCAAAGCCAAGA
2、TGCCCATTGTGGGC121CTGGGCACTTGGAAGTCTCCTCTCGGCAAAGTGAAAGAAGCAGTGAAGGTGGCCATTGAT181GCAGGATATCGGCACATTGACTGTGCCTATGTCTATCAGAATGAACATGAAGTGGGGGAA241GCCATCCAAGAGAAGATCCAAGAGAAGGCTGTGAAGCGGGAGGACCTGTTCATCGTCAGC301AAGTTGTGGCCCACTTTCTTTGAGAGACCCCTTGTGAGGAAAGCCTTTGAGAAG
3、ACCCTC361AAGGACCTGAAGCTGAGCTATCTGGACGTCTATCTTATTCACTGGCCACAGGGATTCAAG421TCTGGGGATGACCTTTTCCCCAAAGATGATAAAGGTAATGCCATCGGTGGAAAAGCAACG481TTCTTGGATGCCTGGGAGGCCATGGAGGAGCTGGTGGATGAGGGGCTGGTGAAAGCCCTT541GGGGTCTCCAATTTCAGCCACTTCCAGATCGAGAAGCTCTTGAACAAACCTGGACTGAAA60
4、1TATAAACCAGTGACTAACCAGGTTGAGTGTCACCCATACCTCACGCAGGAGAAACTGATC661CAGTACTGCCACTCCAAGGGCATCACCGTTACGGCCTACAGCCCCCTGGGCTCTCCGGAT721AGACCTTGGGCCAAGCCAGAAGACCCTTCCCTGCTGGAGGATCCCAAGATTAAGGAGATT781GCTGCAAAGCACAAAAAAACCGCAGCCCAGGTTCTGATCCGTTTCCATATCCAGAGGAAT841GTGATTG
5、TCATCCCCAAGTCTGTGACACCAGCACGCATTGTTGAGAACATTCAGGTCTTT901GACTTTAAATTGAGTGATGAGGAGATGGCAACCATACTCAGCTTCAACAGAAACTGGAGG961GCCTGTAACGTGTTGCAATCCTCTCATTTGGAAGACTATCCCTTCGATGCAGAATATTGA1021GGTTGAATCTCCTGGTGAGATTATACAGGAGATTCTCTTTCTTCGCTGAAGTGTGACTAC1081CTCCACTCATGTC
6、CCATTTTAGCCAAGCTTATTTAAGATCACAGTGAACTTAGTCCTGTT1141ATAGACGAGAATCGAGGTGCTGTTTTAGACATTTATTTCTGTATGTTCAACTAGGATCAG1201AATATCACAGAAAAGCATGGCTTGAATAAGGAAATGACAATTTTTTCCACTTATCTGATC1261AGAACAAATGTTTATTAAGCATCAGAAACTCTGCCAACACTGAGGATGTAAAGATCAATA1321AAAAAAATAATAATCAT
7、該段序列在70---1020bp可以合成蛋白質(zhì)1、將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入到軟件中（PrimerPremier）2、根據(jù)起始密碼子（AUG）和終止密碼子(UAG、UGA、UAA)，點(diǎn)擊“Find”分別找出各位置：ATG：70、106、502、925TAG：1115TGA：1018TAA：1114選擇起始密碼為502，終止密碼為1018.輸入軟件300bp到900bp選擇如下片段5`TCGGCAAAGTGAAAGAAG3`3`CTGATAGGGAAGCTACGT5`根據(jù)所選序列（143—1011）選擇酶切位點(diǎn)在143—1011
8、序列含有的酶切位點(diǎn)有在目的序列外的限制性內(nèi)切酶有選擇EcoRⅠ和XbaⅠ作為雙酶切限制性內(nèi)切酶，EcoRIG^AATTCXbaIT^CTAGA則上游引物序列：5`ATATG^AATTCGAT---TCGGCAAAGTGAAAGAAG3`下游引物序列：5`TGCT^CTAGAT---TGCATCGAAGGGATAGTC3`三、PCR擴(kuò)增1、為了減少非靶序列的擴(kuò)
