微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選方法綜述.docx

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1、論文綜述微衛(wèi)星分子標(biāo)記篩選方法綜述摘要：微衛(wèi)星是一種短的串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequencerepeats,SSR)。它作為一種重要的分子遺傳標(biāo)記，能較好地反映物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究。本文概述了獲得和富集微衛(wèi)星位點(diǎn)的常用方法。最簡(jiǎn)便、最省時(shí)的方法是從從公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如Genbank、EMBL、EST數(shù)據(jù)庫(kù)等）或已發(fā)表的文獻(xiàn)中查找到微衛(wèi)星位點(diǎn)，但只限于已經(jīng)有序列數(shù)據(jù)發(fā)布的物種；第二種方法是種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增，即從相近物種的數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)，或使用已有數(shù)據(jù)發(fā)表的遺傳距離相近物種的微衛(wèi)星

2、標(biāo)記。第三種方法是從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中用于富集微衛(wèi)星的方法有引物法、磁珠雜交法、尼龍膜雜交法以及分子標(biāo)記技術(shù)法。關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星；分子標(biāo)記；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微衛(wèi)星（Microsatellite），又稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SimpleSequenceRepeat,SSR），短串聯(lián)重復(fù)（ShortTandemRepeatSTR），是以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（一般1～6個(gè)）為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)DNA序列。微衛(wèi)星位點(diǎn)廣泛分布于真核生物的基因組中[1]，在植物基因組中平均每33Kb存在一個(gè)20bp長(zhǎng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，而在哺乳動(dòng)物中每6Kb存在一個(gè)20bp長(zhǎng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)[2]。并且SSR的重復(fù)次數(shù)不同

3、和重復(fù)程度不同，使其呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。微衛(wèi)星標(biāo)記共顯性的特點(diǎn)使它能夠用于研究等位基因，區(qū)分二倍體（或多倍體）的純合體或雜合體，這是AFLP、RAPD等顯性標(biāo)記所無(wú)法做到的。另外，微衛(wèi)星的特異性引物擴(kuò)增具有良好的重復(fù)性和保真性，方便各實(shí)驗(yàn)室間的交流。目前，微衛(wèi)星標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用到基因連鎖與遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、譜系和發(fā)育研究、疾病檢測(cè)以及品種鑒定、親本分析與個(gè)體、純系檢驗(yàn)上。隨著微衛(wèi)星標(biāo)記在圖譜上的豐富,將顯現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。但微衛(wèi)星分析中引物的獲得需要預(yù)先獲知核酸序列,其廣泛應(yīng)用受限于從特定的物種中分離微衛(wèi)星位點(diǎn)的難度和花費(fèi)。微衛(wèi)星標(biāo)記分離最大的困難是引物的獲得。同RAPD

4、、AFLP等遺傳標(biāo)記不同，微衛(wèi)星研究首先需要獲知位點(diǎn)的序列信息，以便從重復(fù)序列兩端側(cè)翼的保守序列中設(shè)計(jì)引物。因而微衛(wèi)星引物的開(kāi)發(fā)是應(yīng)用該技術(shù)的關(guān)鍵。目前已知微衛(wèi)星位點(diǎn)的物種很有限，這是因?yàn)槲⑿l(wèi)星位點(diǎn)的獲得需經(jīng)過(guò)克隆、雜交篩選、測(cè)序等步驟，因此需花費(fèi)一定的人力、金錢，這限制了微衛(wèi)星標(biāo)記的大量使用。但近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的各種微衛(wèi)星位點(diǎn)富集技術(shù)已在一定程度上解決了這個(gè)問(wèn)題。已有的最常用的獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法包括：1.從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)；2.遺傳距離相近物種間引物轉(zhuǎn)移擴(kuò)增；3.從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)。其中，最方便、最經(jīng)濟(jì)的方法就是從已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得微衛(wèi)星引物，但該法在使用

5、對(duì)象上，只限于已有引物開(kāi)發(fā)出的物種，而且引物的數(shù)量不會(huì)有所增加，只能停留在原有基礎(chǔ)上。對(duì)于近緣種引物的應(yīng)用，其適用范圍究竟有多大；原物種的微衛(wèi)星基因座在其他物種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增時(shí)，其多態(tài)性如何。這些問(wèn)題使得在不同物種間共用微衛(wèi)星引物時(shí)，盲目性較大，可指導(dǎo)操作的理論依據(jù)不足。最好的途徑就是從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)并進(jìn)行引物的開(kāi)發(fā)。1從數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)在上述三種方法中,最簡(jiǎn)便最省時(shí)的就是從公共數(shù)據(jù)庫(kù)或已發(fā)表的文獻(xiàn)中查找到微衛(wèi)星位點(diǎn)。許多微衛(wèi)星研究的出發(fā)點(diǎn)都是公共數(shù)據(jù)庫(kù)，比如從EMBL、Genbank或EST數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)。從這些數(shù)據(jù)庫(kù)中，可通過(guò)電子查詢方式方便地獲得所需

6、要的序列或?qū)ふ乙汛嬖诘奈⑿l(wèi)星引物。研究者對(duì)大量序列進(jìn)行處理，利用ClustalW等程序，根據(jù)相似性程度，剔除冗余的EST，再剔除過(guò)短的序列（小于100bp）和過(guò)長(zhǎng)的序列（大于1000bp），再利用SSRHunter等軟件搜索獲得含有微衛(wèi)星的序列，并根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物。何蔚[3]等選用前人分離得到的42對(duì)大熊貓微衛(wèi)星引物，分別用圈養(yǎng)大熊貓的血液DNA和野生大熊貓的糞便DNA對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明不同標(biāo)記的多態(tài)性差異較大，并篩選出13對(duì)能較好地應(yīng)用于大熊貓遺傳多樣性研究的微衛(wèi)星引物?？飫倶騕4]等利用生物信息學(xué)方法從公開(kāi)發(fā)表的鱖魚(yú)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找多態(tài)信息含量豐富的

7、微衛(wèi)星位點(diǎn)中共搜索到304條鱖魚(yú)核酸序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)篩選和人工選擇,最終獲得22條含微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列，利用SSRHunter軟件在此22條含有微衛(wèi)星的序列中發(fā)現(xiàn)30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出17對(duì)引物，其余位點(diǎn)兩端序列短無(wú)法設(shè)計(jì)引物。其中13對(duì)引物擴(kuò)增條帶清晰，經(jīng)過(guò)多態(tài)性分析，最終篩選獲得6對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物。徐玲玲[5]等從資料和GenBank中選取擴(kuò)增效果好、等位基因多、均勻分布于小型豬18條常染色體和X染色體上的100個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)合成引物，對(duì)封閉群小型豬基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增及條