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1、石蠟切片和冷凍切片——傻傻分不清楚系列在組織實驗中，組織切片和冷凍切片是最常見的兩種切片方法，兩種優(yōu)缺點明顯，在實驗的應用上也大有不同。而兩個實驗的相同點都是應用免疫學基本原理——即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，對其進行定位、定性及相對定量的研究。一、石蠟切片?組織學常規(guī)制片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學和法醫(yī)學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。1、固定
2、：將新鮮組織切成小塊，固定于4%多聚甲醛過夜。凝固組織中的物質(zhì)成分，盡可能保持其活體時的結(jié)構(gòu)。同時能使組織硬化，有利于切片的進行。2、脫水：為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每次時間為1小時。固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會影響后期的染色效果。3、透明：常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的溶劑，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在透明劑浸漬過程稱透明。4、浸蠟：先把組織材料塊放
3、在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1小時。先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬1小時左右。5、包埋：以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于包埋盒內(nèi)上，然后置于速凍臺，讓石蠟固定。6、切片：切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當都直接影響切片質(zhì)量，可將蠟塊至于冷水中改變蠟塊硬度。通常切片厚度為5微米，用毛筆輕托輕放在37度水浴中展片。7、貼片與烤片：將水浴中展片撈至玻片上鋪正，然后將載玻片放入37℃溫箱中干燥。8、切片脫蠟及水化：干燥后的切片置于二甲苯中進行脫蠟，然后依次使用從高濃度到低濃度遞減的順序進行經(jīng)純酒精、95%、85%、70%進行水化
4、。9、染色：經(jīng)典的蘇木精和伊紅：細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數(shù)細胞質(zhì)及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。實驗操作簡單。免疫組化：指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應。一、冰凍切片：冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進行切片的一種方法。制作過程較石蠟切片快捷、簡便，因多應用于手術中的快速病理診斷。一、取材：應盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。二、速凍：1、將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）。2、如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特
5、制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)。3、當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。4、在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機冰凍切片。5、若需要保存，應快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?。三、固定?、樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。2、取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。3、組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。四，切片：1、恒溫冰凍切片機為
6、較理想的冰凍切片機，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10μm。2、切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃~?-20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。3、切好室溫放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。4、進行抗原熱修復，微波熱修復也可，室溫自然冷卻?？捎?%H2O2孵育5-10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。五、免疫熒光染色：1、冰凍切片室溫晾干15min，可用含10%正常
7、山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時（此步可不洗）。2、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個過程中不會使組織干涸）。3、將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時或4℃過夜。4、第二天先將濕盒放到37℃回溫1h，然后吸取片上的一抗進行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。5、滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37℃孵育1小時。回收二抗，切片置于染缸內(nèi)，PBS洗5min×3次。6、滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15m
8、in）。7、回收DAPI，滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。8、做好的切片放在切片盒內(nèi)，置于4℃冰箱，可保存一周左右。對比：石蠟切片冷凍切片應用對象廣泛應用常規(guī)制片手術中的快速病理診斷保持時間持久保
