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《征求意見稿-鴨肝炎病毒1型和3型雙重RT-PCR檢測方法.docx》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號?????DB34安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)DB34/XXXXX—XXXX?????鴨肝炎病毒1型和3型雙重RT-PCR檢測方法DuplexRT-PCRassayfordetectionofduckhepatitisvirustype1andtype3點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識?????XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施?????安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局???發(fā)布DB34/XXXXX—XXXX前言本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)
2、準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心等本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：潘孝成、占松鶴等6DB34/XXXXX—XXXX鴨肝炎病毒1型和3型雙重RT-PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨肝炎病毒1型（DHV-1）和鴨肝炎病毒3型（DHV-3）雙重RT-PCR檢測方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨病變肝組織、接種疑似病料的鴨胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物中DHV-1型和/或DHV-3型核酸的檢測。2縮略語下列縮略語適用于本文件。DHV：鴨肝炎炎病毒(duckhepatitisvirus）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（rev
3、ersetranscription-polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸緩沖液（phosphatebuffe
4、rsolution）TAE：Tris-乙酸電泳緩沖液（trisacetate-EDTAbuffer）EB：溴化乙錠（ethidiumbromide）3主要儀器3.1PCR擴(kuò)增儀。3.2臺式低溫高速離心機(jī)（最大離心力12000g以上）。3.3電泳儀。3.4凝膠成像系統(tǒng)。3.5冰箱（-20℃；-80℃）。3.6微波爐。3.7分析天平（準(zhǔn)確度0.01g以上）。6DB34/XXXXX—XXXX3.8水浴鍋。3.9微量移液器（2.5μL；10μL；200μL；1000μL）。4試劑和材料4.1RNA抽提試劑：Trizol或其他商品化RNA提取試劑。4.2氯仿、異丙
5、醇、無水乙醇。4.3M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。4.4RNA酶抑制劑。4.5DEPC處理的滅菌水。4.6TaqDNA聚合酶。4.7dNTP。4.8DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker）。4.9RT-PCR反應(yīng)試劑。4.10EB（10μg/μL）或核酸染料。4.11磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），見附錄A中的A.1。4.1250×TAE電泳緩沖液，見附錄A中的A.2。4.131%瓊脂糖凝膠，見附錄A中的A.3。4.14引物：DHV-1擴(kuò)增上游引物，5’-GGTGATTCTAACCAGTTGGGG-3’，下游引物，5’-TTCAATTTCC
6、AGATTGAGTTCAAA-3’；DHV-3擴(kuò)增上游引物，5’-GATGTAGTTATGGTGCTTAGACGC-3’，下游引物，5’-ACGAACCAGCCATTGACG-3’，引物濃度均為10pmol/μL。4.15陽性對照樣品：DHV-1和DHV-3鴨胚接種尿囊液毒；陰性對照樣品：正常鴨胚尿囊液。5樣品的采集及處理5.1采樣工具15mL離心管、1.5mL離心管、剪刀、鑷子和研缽，經(jīng)121（±2）℃，15min高壓滅菌并烘干。5.2采樣方法5.2.1鴨病變肝組織6DB34/XXXXX—XXXX采取病死或剖殺鴨的肝組織1g左右，按1:5倍體積加入PB
7、S，研磨凍融3次，裝入15mL滅菌離心管中，8000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.2鴨胚尿囊液和細(xì)胞培養(yǎng)物鴨胚尿囊液、細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?RT-PCR檢測6.1RNA提取6.1.1用Trizol或其他商品化RNA提取試劑提取待測樣品、陽性對照和陰性對照樣品的RNA。6.1.2200μL的樣品和800μLTrizol置于一個1.5mL離心管，反復(fù)顛倒混勻，室溫靜置5min。6.1.312000g4℃離心5min，吸取上清液移入新的離心管中，加入200μL氯仿，用手劇烈
8、振蕩15s，室溫靜置5min。6.1.412000g4℃離心15min，吸取上清
