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1、第三章酶的生產(chǎn)、分離和純化酶來(lái)自生物體，包括動(dòng)物、植物和微生物。酶的生產(chǎn)：經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作控制而獲得所需要酶的過(guò)程。酶生產(chǎn)的方法：1、提取2、化學(xué)合成3、發(fā)酵法第一節(jié)酶的發(fā)酵生產(chǎn)50年代后期酶生產(chǎn)的主要方法，指利用動(dòng)植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞，主要是微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)而獲得人們所需要的酶的過(guò)程，稱(chēng)為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。1894年，日本人高峰讓吉首次用米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶作為消化劑。1917年，Boidin與Effront以枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶用于織物退漿。1947年，日本開(kāi)始采用液體深層發(fā)酵生產(chǎn)a-淀粉酶。利用微生物發(fā)
2、酵方法制取酶的優(yōu)點(diǎn)是：1）微生物種類(lèi)繁多，酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣；2）微生物生長(zhǎng)繁殖快，發(fā)酵周期短，易提取酶，特別是胞外酶；3）微生物培養(yǎng)簡(jiǎn)單，培養(yǎng)基來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜。4）可采用微電腦等技術(shù)控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。5）可利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育新菌種、增加酶產(chǎn)率和開(kāi)發(fā)新酶種。1、產(chǎn)酶菌的獲得1）生產(chǎn)菌的要求u安全可靠，不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)生上與病原體無(wú)關(guān)，也不產(chǎn)生毒素。FDA(FoodandDrugAdministration)鑒定、審核后認(rèn)為可用于食品工業(yè)和
3、醫(yī)藥工業(yè)的生產(chǎn)菌有：枯草桿菌（Bac.subtilis）、黑曲霉（Asp.niger）、米曲霉（Asp.oryzae）、啤酒酵母（Sac.cereusia）、脆壁酵母（Sac.fragieis）。u不易變異退化、不易感染噬菌體，產(chǎn)酶穩(wěn)定性好。u產(chǎn)酶量高，酶的性質(zhì)符合應(yīng)用需要，最好是產(chǎn)胞外酶的菌株。u能利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短，容易培養(yǎng)。產(chǎn)酶菌可從菌種保存機(jī)構(gòu)如ATCC（AmericanTypeCultureCollection）和有關(guān)研究機(jī)構(gòu)獲得；一般都是通過(guò)篩選（screening）得到。篩選包括以下環(huán)節(jié)：菌樣采集，菌
4、種分離、純化和生產(chǎn)性能鑒定。2）常見(jiàn)的產(chǎn)酶微生物細(xì)菌：枯草桿菌淀粉酶制糖、脫漿大腸桿菌青霉素酰化酶制備青霉素母核異型乳酸桿菌葡萄糖異構(gòu)酶制果糖短小芽孢桿菌堿性蛋白酶皮革脫毛酵母：假絲酵母脂肪酶、尿酸酶等乳品增香、絹絲脫脂等啤酒酵母用于釀造啤酒、飲料酒和酒精等霉菌：黑曲霉酸性蛋白酶啤酒澄清、醫(yī)藥紅曲霉葡萄糖淀粉酶制葡萄糖米曲霉糖化酶和蛋白酶制果糖青霉葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酶、果膠酶等木霉纖維素酶根霉淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等毛霉蛋白酶、糖化酶、果膠酶、凝乳酶等3）菌樣采集為獲得能夠降解某種物質(zhì)的產(chǎn)酶菌株，
5、一般可從該物質(zhì)比較豐富的地方尋找。相近菌種產(chǎn)生的酶在性質(zhì)上一般相近或相似。胞外酶的穩(wěn)定性和最適反應(yīng)條件通常和菌的最適生長(zhǎng)條件一致；但胞內(nèi)酶的熱穩(wěn)定性通常比菌的最適生長(zhǎng)溫度稍低。4）菌種分離、純化和生產(chǎn)性能的鑒定產(chǎn)酶菌可采用平板劃線(xiàn)法或直接稀釋法分離純化。初篩多采用平板透明圈法。如篩選水解酶的生產(chǎn)菌，可以該酶的底物作為平板培養(yǎng)基的主要碳源或氮源，這樣如果菌株包含所需要的酶，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，就會(huì)在菌落的周?chē)纬梢煌该鞯乃馊Γ╟learingorlysiszone），從透明圈的大小可大致判斷出菌株的產(chǎn)酶能力。5）產(chǎn)酶菌
6、的篩選：主要依靠其催化的反應(yīng)的性質(zhì)、底物和產(chǎn)物的特異性等進(jìn)行設(shè)計(jì)。胞外酶篩選：使待檢測(cè)的微生物在含有酶作用的不溶性底物如淀粉、纖維素、酪素、細(xì)胞壁等作為培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)后，根據(jù)菌落周?chē)a(chǎn)生的透明圈的大小可以曬選到產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶和溶菌酶的高活性菌株。(平板透明圈法)根據(jù)催化反應(yīng)的產(chǎn)物的酸堿性，在培養(yǎng)基中加入底物和酸堿指示劑，培養(yǎng)后，依據(jù)產(chǎn)生酸或堿，依據(jù)菌落周?chē)兩Φ拇笮『皖伾顪\進(jìn)行判斷，從而進(jìn)行產(chǎn)目標(biāo)酶菌株的曬選。設(shè)計(jì)特定的底物，使其在酶的作用下產(chǎn)生產(chǎn)物，產(chǎn)物遇底物有顏色的變化，菌落周?chē)a(chǎn)生色圈，則可篩選
7、到產(chǎn)酶的菌株。胞內(nèi)酶篩選：對(duì)于酶作用的底物分子質(zhì)量較小，能透過(guò)細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生反應(yīng)，可以將其加在培養(yǎng)基中，根據(jù)菌落的顏色進(jìn)行篩選。對(duì)于大多數(shù)的胞內(nèi)酶，是采用培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞破碎物作酶源，經(jīng)酶反應(yīng)后，根據(jù)酶反應(yīng)產(chǎn)物的特點(diǎn)，利用產(chǎn)物對(duì)紫外的吸收，如輔酶NAD，直接用紫外分光光度法測(cè)定；或通過(guò)產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。2.產(chǎn)酶菌的保存和培養(yǎng)1）菌種的保存防止污染，盡量減少轉(zhuǎn)移次數(shù)；避免對(duì)種子培養(yǎng)基進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間高熱滅菌，以防對(duì)種子產(chǎn)生不良影響。菌種保存的基本原理：通過(guò)采用低溫、干燥與缺氧的條件，以中止菌種的繁殖，降低其新陳代謝，使之處于休
8、眠狀態(tài)。菌種保存的方法很多，常用的為斜面低溫保存法，液體石蠟保存法等。有條件的還可采用冷凍真空干燥保存法。2）菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)以恢復(fù)菌種的活力，這就叫菌種活化。為了發(fā)酵時(shí)有足夠的菌種，活化了的菌種一般要經(jīng)過(guò)一級(jí)至數(shù)級(jí)的擴(kuò)大培養(yǎng)。3）培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)。又稱(chēng)表面培養(yǎng)
