elisa方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

《elisa方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、ELISA方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用來源：www.nearlw.com　　1.ELISA的基本原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種具有高特異性和高敏感性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，幾乎所有的可溶性抗原一抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)，它的最小可測(cè)值達(dá)ng甚至pg水平。該方法的基本原理如下：(1)將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體(目前以聚苯乙烯微量滴定板最為常用)表面，并保持其免疫活性?！　〈瞬襟E稱為“固相載體的包被”，在商品化試劑盒中均已完成。(2)再將抗原或抗體與某種酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)連接成酶

2、標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。檢測(cè)時(shí)，按相應(yīng)順序加入待檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體，使其與固相載體上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。以洗滌的方法洗去各步驟中過量的未結(jié)合物質(zhì)，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。(3)最后加入酶反應(yīng)的底物，底物即被酶催化生成有色產(chǎn)物，而有色產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定量分析。此種顯色反應(yīng)可通過酶標(biāo)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感

3、的檢測(cè)方法?！　?.ELISA技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用ELISA步驟復(fù)雜，試劑制備困難，只有應(yīng)用符合要求的試劑和標(biāo)準(zhǔn)化的操作，才能獲得滿意的結(jié)果。目前應(yīng)用較廣的檢測(cè)項(xiàng)目一般均有試劑盒出售，完整的ELISA試劑盒應(yīng)包含已包被好的固相載體、酶結(jié)合物、底物和各種濃縮的稀釋液、緩沖液等。　　在醫(yī)學(xué)研究中，ELISA試劑檢測(cè)的項(xiàng)目主要可分為以下幾類：(1)各種病原體及其抗體的檢測(cè)：如肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、艾滋病病毒等；(2)蛋白質(zhì)：腫瘤標(biāo)志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等；激素如HCG、FSH、TSH等；細(xì)胞因子如TNF．0l、VEGF、N

4、FKB等；載脂蛋白如ApoA—I、ApoE等；(3)非肽類激素：如T3、rr4、雌二醇、皮質(zhì)醇等；(4)檢測(cè)血液中的藥物濃度：如治療心臟病的藥物地高辛、抗癲癇藥物茶堿、抗生素慶大霉素等?！　∮糜诨A(chǔ)研究的標(biāo)本來源多種多樣，如臨床血液標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織標(biāo)本，培養(yǎng)的細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)上清等，均可作為待測(cè)樣本用于檢測(cè)其中某種物質(zhì)的含量。具體應(yīng)選取何種樣本進(jìn)行特定指標(biāo)的檢測(cè)，取決于實(shí)驗(yàn)研究的目的以及待測(cè)物質(zhì)的表達(dá)特性。　　3.ELISA在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用特點(diǎn)ELISA方法在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用與其在臨床檢驗(yàn)工作中具有很大不同，區(qū)別之

5、處主要如下：(1)基礎(chǔ)研究中ELISA檢測(cè)所用標(biāo)本來源廣泛，涉及人、大鼠、小鼠、兔、豬、犬等多種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的血液、組織、細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液等，而臨床檢驗(yàn)所用標(biāo)本則以人的血液(血清或血漿)和尿液等為主；(2)基礎(chǔ)研究具有探索性，其結(jié)果也具有不確定性，沒有正常值范圍而言，需要根據(jù)ELISA檢測(cè)指標(biāo)的具體數(shù)值判斷不同實(shí)驗(yàn)組間樣品測(cè)定值的意義；而臨床檢驗(yàn)的ELISA檢測(cè)結(jié)果具有陽性或陰性的界定，或者存在正常值范圍作為判讀測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。(3)對(duì)于臨床檢驗(yàn)標(biāo)本如血清和血漿而言，各種指標(biāo)的ELISA檢測(cè)試劑盒均會(huì)給出對(duì)待測(cè)樣品的最佳稀釋倍數(shù)；而在基

6、礎(chǔ)研究中，尤其當(dāng)所測(cè)指標(biāo)是在組織中表達(dá)時(shí)，即待測(cè)樣品來源于組織時(shí)，ELISA檢測(cè)試劑盒通常不會(huì)推薦對(duì)待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)；此時(shí)，研究者必須先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出一個(gè)最佳稀釋倍數(shù)之后再進(jìn)行檢測(cè)，因此，對(duì)組織樣本的檢測(cè)步驟較為復(fù)雜和繁瑣。　　4.ELISA的分類及主要操作流程ELISA方法既可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。根據(jù)樣本中待測(cè)物質(zhì)的種類及性質(zhì)不同，可以設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。臨床檢驗(yàn)工作中用到的ELISA方法主要分為以下幾種類型：(1)用于檢測(cè)抗原的：雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法；(2)用于檢測(cè)抗體的：雙抗原夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法及捕獲包被法等

7、。然而，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，涉及到的檢測(cè)指標(biāo)大多數(shù)為抗原性物質(zhì)，因此，下文僅就雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法這兩種測(cè)定抗原性物質(zhì)的方法進(jìn)行詳細(xì)說明?！　?．1雙抗體夾心法檢測(cè)抗原研究表明，充血性心力衰竭患者循環(huán)及組織中自介素一6(inter—leukin-6，IL-6)升高，持續(xù)過度的IL-6產(chǎn)生會(huì)破壞細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)并可能導(dǎo)致心肌損傷及功能障礙的進(jìn)展，因此，循環(huán)IL-6水平與左室功能障礙的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在此，以檢測(cè)大鼠血漿IL-6為例說明雙抗體夾心法的ELISA操作步驟和要點(diǎn)?！　?．1．1操作流程(1)取出試劑盒，置室溫平衡30min；(2)按照說明書

8、要求配制各種工作液：洗液、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及樣品稀釋液等；(3)根據(jù)說明書推薦的樣品稀釋度對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行稀釋，同時(shí)按照說明書要求配制各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(從空白