生化藥物分析及生物檢定技術(shù)課件.ppt

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1、定義：指運(yùn)用生物化學(xué)的理論、方法和技術(shù)，從動(dòng)、植物等生物體中提取分離的天然活性物質(zhì)，以及這些物質(zhì)及其衍生物的化學(xué)合化、半合成和現(xiàn)代生物技術(shù)制得的產(chǎn)品。生化藥物分析常測(cè)定：氨基酸及其衍生物、藥用活性多肽、藥用蛋白、藥用酶、輔酶、核酸及其降解產(chǎn)物和衍生物、多糖和脂類藥物、基因工程DNA重組藥物等。優(yōu)點(diǎn)：易被機(jī)體吸收，針對(duì)性強(qiáng)，療效可靠，毒副作用小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等。一、生化藥物分析的特點(diǎn)1、分子量不確定性(1)只有氨基酸、核苷酸、輔酶、甾體激素等化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合物，分子量確定。(2)大多分子量不確定，結(jié)構(gòu)不確

2、定因此，生化藥物常需進(jìn)行純度及分子量測(cè)定。2、分析項(xiàng)目的特殊性(1)除采用理化法分析外,尚需用生物檢定法進(jìn)行檢定,以證實(shí)其生物活性(2)因易引入雜質(zhì)，常需做熱源、熱敏、異常毒性、安全性試驗(yàn)(3)多用含量測(cè)定表示主藥含量，但酶類需進(jìn)行效價(jià)/酶活力測(cè)定，來(lái)表示有效成分含量。3、分析方法的多樣性如：理化、生化、生物檢定法等。二、生化藥物分析的方法1、鑒別(1)化學(xué)反應(yīng)法(2)UV(3)酶法：如尿激酶-蛋白水解酶(4)電泳法：如肝素-糖凝膠電泳法(5)生物法：利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)2、雜質(zhì)檢查(1)一般雜質(zhì)(2)特殊雜質(zhì)

3、3、安全性檢查(1)熱原檢查：由微生物所分泌的某一種代謝產(chǎn)物，一般以為是內(nèi)毒素，能使恒溫動(dòng)物體溫升高。方法：家兔法/鱟試劑(2)異常毒性試驗(yàn)用一定劑量藥物按指定的操作方法和給藥途徑給規(guī)定體重的試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急毒反應(yīng)(是否死亡)，是一個(gè)限度試驗(yàn)。異常毒性試驗(yàn)出現(xiàn)：主要取決于供試品在生產(chǎn)中是否引入，可發(fā)生異常毒性雜質(zhì)。(3)過(guò)敏試驗(yàn)檢異性蛋白試驗(yàn)----引起多種過(guò)敏反應(yīng)輕:皮膚產(chǎn)生紅斑/丘疹過(guò)敏重:窒息、發(fā)紺、血管神經(jīng)性水腫血壓降低、休克、死亡。(4)降壓物質(zhì)檢查指藥物中含有能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組

4、胺或其他物質(zhì)。來(lái)源：用動(dòng)物臟器/組織制備時(shí)，在正常組織中存在。方法：貓/狗血壓法檢藥物中所含降壓物質(zhì)。(5)無(wú)菌檢查對(duì)藥物及敷料是否染有活菌的檢查。由于許多生化藥物不能高溫滅菌，故檢查此項(xiàng)。4、含量/效價(jià)測(cè)定表示方法：(1)含量百分比：適用于化學(xué)結(jié)構(gòu)明確小分子/經(jīng)水解后變成小分子藥物。(2)生物效價(jià)/酶活力單位表示，適于酶類、蛋白質(zhì)類。常用方法：(1)酶法(2)電泳法(3)生物檢定法(4)理化法(1)酶法①酶活力測(cè)定法：a.終點(diǎn)法：?jiǎn)蚊阜磻?yīng)定量法指示酶反應(yīng)偶聯(lián)定量法b.取樣測(cè)定法c.連續(xù)測(cè)定法②酶分析法：a.

5、動(dòng)力學(xué)分析法b.總變量分析法(2)電泳法①自由界面電泳法②高效毛細(xì)管電泳法③區(qū)帶電泳法a.紙電泳法b.醋酸纖維素薄膜電泳法c.聚丙烯酰胺凝膠電泳法d.十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳法(3)生物檢定法是利用藥物對(duì)生物體的作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)供試品和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谝欢l件下比較產(chǎn)生特定生物反應(yīng)的劑量比例，來(lái)測(cè)得供試品的效價(jià)。(4)理化法①重量法a.提取法b.揮發(fā)法c.沉淀法②測(cè)定法③比色法④UV⑤高效凝膠過(guò)濾色譜

6、法a.分離根據(jù)有效粒徑b.分離在固定比例水液中c.活性蛋白可回收⑥高效離子交換色譜法a.分離根據(jù)離子化濃度b.分離鹽濃度增大的梯度洗脫法c.分離在陽(yáng)/陰離子交換間呈現(xiàn)差異大d.柱效中等并具高質(zhì)量的活性回收三、生化藥物分析進(jìn)展總體向理化/儀器分析發(fā)展如：GC、HPLC、UV、TR、質(zhì)譜、磁共振、超離技術(shù)、放射免疫、酶試劑、酶電極檢測(cè)等。另，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)生化藥的活力和效價(jià)檢測(cè)。單克隆體免疫分析技術(shù)及基因分析技術(shù)，提高檢測(cè)限量和靈敏度。生物檢定技術(shù)第一節(jié)微生物限度檢查一、定義微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑

7、及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。二、檢查方法藥品微生物限度檢查采用活菌計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法包括：平皿法、薄膜過(guò)濾法。一、平皿法1．設(shè)備、儀器及用具無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱(室)、勻漿儀、恒溫水浴箱、電熱干燥箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器、菌落計(jì)數(shù)器(JLQ-ST或JLQ-S2型)、顯微鏡(1500×)、天平(感量0.1g)、錐形瓶、研

8、缽(直徑10～12mm)、培養(yǎng)皿(直徑90mm)、量筒、試管及塞子、吸量管(1mL、10mL)、載玻片、蓋玻片、玻璃或搪瓷消毒缸(帶蓋)、大橡皮乳頭、小橡皮乳頭、無(wú)菌衣、無(wú)菌褲、無(wú)菌帽、無(wú)菌口罩(也可用一次性物品替代)、接種環(huán)、酒精燈(乙醇燈)、乙醇棉球、滅菌剪刀及鑷子、滅菌稱樣紙及不銹鋼藥勺、試管架、火柴、記號(hào)筆、白瓷盤、洗手盆等。玻璃器皿均于160℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽滅菌12l℃20min，