人lrp蛋白多克隆抗體的制備

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1、人Lrp蛋白多克隆抗體的制備作者：于欣平，宋慶賀，侯立朝，杜可軍，熊利澤，陳蘇民，陳南春，代忠明【摘要】目的：制備人Lrp蛋白多克隆抗體.方法：克隆全長lrpcDNA編碼序列并進(jìn)行原核表達(dá)與鑒定.用鎳離子螯合柱(NiNTA)純化原核表達(dá)的全長Lrp蛋白，獲得純度較高的目的蛋白.用純化后蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體并吸附去除非特異性反應(yīng)成分.結(jié)果：018360）.本課題組克隆了全長lrpcDNA編碼序列并進(jìn)行了原核表達(dá)與鑒定［3］.分析表明，全長人lrp編碼528個(gè)氨基酸，并有亮氨酸拉鏈的特征結(jié)構(gòu).本實(shí)驗(yàn)對(duì)原核表達(dá)的Lrp

2、蛋白進(jìn)行純化，用純化后的蛋白免疫新西蘭大白兔制備抗血清.　　1材料和方法　　1.1材料大腸桿菌BL21(DE3)由本室保存；重組人lrp融合表達(dá)載體pcTAThlrp由本課題組構(gòu)建保存.LPS(Sigma公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及化學(xué)發(fā)光底物(Pierce公司)；弗氏完全、不完全佐劑(GibcoBRL公司)；NiNTA純化系統(tǒng)(Qiagen公司)；純種新西蘭大白兔(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心).　　1.2方法　　1.2.1Lrp的表達(dá)純化將重組人lrp融合表達(dá)載體pcTAThlrp轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌，挑

3、單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后IPTG（終濃度為0.2mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)6HisTATLrp融合蛋白.將誘導(dǎo)后的菌液2292g/min離心10min，收集菌體，用STE(100g/L蔗糖,10mmol/LTrisClpH8.0,1mmol/LEDTApH8.0)洗1遍；離心收集菌體后用STE重懸，超聲破碎菌體(整個(gè)過程均在冰浴中)，13201g，4℃，離心30min，收集包涵體沉淀，再用包涵體溶解緩沖液（50mmol/LTrisClpH8.0,1mmol/LEDTApH8.0,100mmol/LNaCl,8mol/L尿素）溶解沉淀，1

4、3201g/min，4℃，離心30min，收集上清；用鎳離子金屬螯合柱(NiNTA)純化Lrp蛋白(按公司提供的操作說明進(jìn)行)，并作SDSPAGE分析.　　1.2.2抗體制備用約40μg純化的Lrp蛋白于脊柱兩側(cè)多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，免疫周期為0d,7d,28d,35d.第1次加弗氏完全佐劑，其余3次加弗氏不完全佐劑.第4次免疫1in離心10min去除殘留紅細(xì)胞.將制備的抗血清按1∶104稀釋，以免疫前兔血清為對(duì)照對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)Lrp后的全菌蛋白樣品進(jìn)進(jìn)行g(shù)）作用1.5h，加脫氧膽酸鈉（每克濕菌4mg）攪動(dòng)10min，再加1g/

5、L的DNaseⅠ（每克濕菌4μL），攪拌直至不再粘稠(以上操作均在冰浴進(jìn)行)；此時(shí)向裂菌液中加入等體積的4℃預(yù)冷丙酮，混勻，冰浴30min沉淀全菌蛋白，然后5867g,4℃離心10min收取全菌蛋白沉淀；沉淀用PBS洗滌1遍后與所制備抗血清于37℃搖動(dòng)共孵2h吸附去除非特異性反應(yīng)成分.將吸附前和吸附后的抗體分別按1∶103,1∶104,1∶105,1∶106稀釋作一抗，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)Lrp后的全菌蛋白樣品進(jìn)行g(shù)蛋白，且純度較高(圖2).　　圖1－圖2　略　　2.2抗血清的檢測(cè)用收集未純化抗血清作一抗，以免疫前兔血清為對(duì)照對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)Lrp

6、后的全菌蛋白樣品進(jìn)進(jìn)行WesternBlot分析，結(jié)果顯示（圖3），用所制備的抗血清在69ku位置明顯雜到了一條預(yù)期的條帶，而對(duì)照血清泳道相同位置處無相應(yīng)條帶出現(xiàn).說明所制備抗血清中確有一定濃度的抗目的蛋白的抗體.　　圖3所制備抗血清的P).LPS進(jìn)入體循環(huán)時(shí),就會(huì)形成內(nèi)毒素血癥,引起明顯的病理生理反應(yīng).　　　　近年來的實(shí)驗(yàn)顯示［4］,LPS除引起危及生命的G-菌毒血癥外,也參與一些局部特定疾病，如泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)疾病.目前認(rèn)為LPS也是引起人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒性休克的主要因素［5］.而所有這些作用的發(fā)

7、揮，都是藉一系列被稱為模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptors,PRRs)［6］的膜蛋白分子對(duì)LPS識(shí)別［7-9］，以及一系列相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)所識(shí)別信號(hào)的傳遞和放大來實(shí)現(xiàn)的.LPS信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常復(fù)雜，單憑現(xiàn)有的信號(hào)傳導(dǎo)分子很難解釋其中的一些通路.研究LPS的致病機(jī)制，必須尋找新的信號(hào)傳導(dǎo)分子.　　　　人lrp就是新發(fā)現(xiàn)的一種LPS應(yīng)答基因.功能位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn),lrp的基因序列中包含兩條相互重疊的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)［Lx(6)Lx(6)Lx(6)L］.亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)是DNA結(jié)合蛋白的特征型

8、結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)往往出現(xiàn)在幾種特定的蛋白質(zhì)中：即與細(xì)胞生長代謝相關(guān)的分子中（如轉(zhuǎn)錄因子、癌基因）.對(duì)lrp進(jìn)行研究可能會(huì)有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)LPS介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加對(duì)炎癥反應(yīng)分子機(jī)制的認(rèn)識(shí).并可能為內(nèi)毒素血癥等LPS相關(guān)疾病尋找新的治療