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1、前 言液相色譜的分離原理是,在色譜柱流動相中樣品的不同組分與固定相發(fā)生吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等作用,由于作用力的大小、強弱不同,各種組分在固定相中滯留的時間也不同,因而先后從以固定相中流出而得到分離。因此液相色譜分離的關(guān)鍵之一是色譜柱中的固定相。柱效的好壞直接影響目標(biāo)化合物的分析和檢測。但在液相色譜運行過程中,色譜柱極易發(fā)生問題,因此掌握正確使用和維護色譜柱的知識非常必要。色譜柱使用過程中容易發(fā)生柱堵塞引起系統(tǒng)壓力過高;柱效低引起峰拖尾、變寬;柱污染、損壞導(dǎo)致鬼峰等問題。引起這些問題的內(nèi)在原因有:(1)硅羥基的死吸附。色譜柱的基
2、材硅膠粒子表面存在硅膠羥基。任何物質(zhì)在色譜柱中都存在雙分配效應(yīng),即在流動相與固定相之間進行分配,又在流動相與硅羥基之間進行分配。被分析物質(zhì)被硅羥基吸附稱為非特異性吸附,或稱死吸附。當(dāng)硅羥基對被分析物質(zhì)的吸附趨近于飽和狀態(tài)時,色譜柱柱效下降,峰形出現(xiàn)拖尾、變寬。(2)重金屬。色譜柱的基材硅膠粒子無論純度多高,無論怎樣處理,都會有不少于5×10-6的重金屬以金屬氧化物的形式殘存在硅膠粒子的表面,這些金屬氧化物很容易與其它化合物形成螯合物,使其被氧化,產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰。例如兒茶素和大多數(shù)中藥,因含有多酚結(jié)構(gòu),極易被金屬氧化物氧化,影響其分離
3、效果。(3)碳流失。固定相經(jīng)長期使用,會有部分碳鏈被流動相洗脫下來,隨流動相一起流出色譜柱外,造成碳流失。(4)緩沖液中鹽的析出。在做色譜分析時,有時流動相中會含有緩沖鹽溶液。分析結(jié)束后,如果沒有先用含一定配比的水相流動相沖洗,而直接用純有機相沖洗,瞬間柱子中的微環(huán)境是高有機相、低水相。這時流動相中的緩沖鹽溶液極易析出鹽,將柱子堵塞,使柱壓升高,柱效下降。(5)色譜柱變干。如果對色譜柱保存不當(dāng),使色譜柱中的保存液全部揮發(fā),柱子內(nèi)部變干,造成色譜柱的損傷,影響分離效果。2 色譜柱的使用新柱使用前應(yīng)先檢查產(chǎn)品包裝、外觀是否完好。認(rèn)真閱讀說明書
4、及性能測試報告,了解新柱子的最佳性能指標(biāo),如某色譜條件下的柱壓、柱效等。有時分析用的流動相與柱子的保存試劑不同,故在分析樣品之前,應(yīng)使用合適的試劑將柱子中的保存試劑清洗出來。要注意清洗用的流動相與保存溶劑的相溶性。反相C18柱通過出廠測試后多保存在乙腈中,可用10~20倍柱體積的甲醇或乙腈來平衡色譜柱。流速要緩慢提高,如開始0.3~0.5mL/min,10~15min后可慢慢加快。硅膠柱和極性色譜柱通過出廠測試后一般保存在正庚烷中。如果分析時需要使用含水的流動相,則使用前須用乙醇或異丙醇沖洗,流速0.1~0.3mL/min,將正庚烷沖洗干
5、凈后,再用流動相平衡。實驗過程中可以記錄色譜柱的一些性能指標(biāo),如柱效、柱壓等,供今后參考。每次分析樣品前,要用流動相對色譜柱進行平衡,待基線平穩(wěn)后再進樣分析。梯度洗脫用初始流動相平衡。一次樣品分離完成后,要有足夠的時間使系統(tǒng)恢復(fù)平衡,再進行下一次分析。一般流動相平衡時間為30min,若系統(tǒng)中有鹽或水,平衡時間應(yīng)延長。3 色譜柱的清洗與保存色譜柱清洗是日常的重要維護工作。如果樣品分子殘留在柱子、接頭、流通池中,會污染系統(tǒng),影響對其它樣品的分析,降低柱效。因此分析工作結(jié)束后,要用適當(dāng)?shù)娜軇┣逑聪到y(tǒng)中殘留的樣品。在反相系統(tǒng)中,若流動相中無酸、堿
6、、鹽類物質(zhì),可用90%甲醇沖洗30~60min,若含酸、堿、鹽類物質(zhì),則要先用10%甲醇或乙腈,或用與分析用流動相相同的比例把含酸、堿、鹽溶液換成水,沖洗30~60min,再用50~70%甲醇或乙腈沖洗,最后用100%甲醇或乙腈沖洗。若有四元泵,可用梯度達(dá)到90%的甲醇沖洗。直接用純甲醇或乙腈沖洗,會導(dǎo)致磷酸鹽沉淀于柱子或檢測池中。最好也不要用100%純水沖洗柱子。純水極性很強,ODS填料的硅烷鍵是非極性的,在純水中各鍵合基團會因疏水而改變性能,使柱效很快降低。目前已有公司推出可以使用100%純水的柱子,原理是鍵合基團互相之間有排斥力,阻
7、止了鍵合基團性能的改變。能否用純水沖洗要看柱子說明書的規(guī)定。有機相(如甲醇、乙腈)-水體系流動相能完成大部分析工作,但是有時分析弱酸或弱堿化合物時(如生物堿),為消除拖尾現(xiàn)象,需用離子對試劑。常用的離子對試劑有庚烷磺酸鈉和十二烷基磺酸鈉,這時常采用pH3~5的緩沖鹽體系。離子對色譜分離結(jié)束后,柱子應(yīng)先用有機溶劑-水體系沖洗,再用水沖洗,最后用有機溶劑沖洗。假設(shè)流動相是甲醇-0.5%庚烷磺酸鈉(pH3.3)(VnV=50n50),應(yīng)先用50%的甲醇水沖洗,然后用水沖洗,最后用甲醇沖洗。這是因為十二烷基硫酸鈉和庚烷磺酸鈉都是表面活性劑,可以洗
8、掉脂肪油(如烷烴及其衍生物)。如果先用水沖洗,十二烷基硫酸鈉和庚烷磺酸鈉會將ODS柱膠表面鍵合的長鏈烷烴洗脫下來,造成固定相的損失。如果先用有機相-水體系沖洗柱子,由于表面活性劑在有機相中有一