鎳柱子純化表達(dá)蛋白的具體步驟.doc

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1、鎳柱子純化表達(dá)蛋白的具體步驟，注意事項(xiàng)?。?！1、????過柱前的注意事項(xiàng)：a、????樣品必須澄清、無顆粒物，否則會(huì)堵塞柱子、縮短其使用壽命；b、????包含體洗滌的最后一步及溶解時(shí)所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；c、????確保樣品及BindingBuffer中有適量的NaCl，以防止雜離子與Ni離子競爭；2、????過Ni柱的操作步驟：a、用去離子水洗滌，洗去20％的乙醇、除盡基質(zhì)中的空氣，并能防止下一步中Ni離子沉淀；b、5×柱體積的ChargeBuffer（50mMNiSO4）充電；c、5×柱體積的去離子水洗滌，去游離的Ni離子；d、??

2、??10×柱體積的BindingBuffer（20mMTris-HCl,0.5MNaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；e、????上樣（手工上樣，樣品體積應(yīng)根據(jù)目的蛋白的濃度來確定）；f、????20×柱體積的WashingBuffer（20mMTris-HCl,0.5MNaCl,20-50mM咪唑，pH8.0）洗滌，至無蛋白檢出，收集流出液；g、????ElutionBuffer（20mMTris-HCl,0.5MNaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脫，每次1ml，應(yīng)呈現(xiàn)正態(tài)分布（兩邊稀，中間濃）；h、????10×柱體積的BindingBuffe

3、r洗滌。此時(shí)，即可用于純化同種蛋白，很少需要重新充電。注：同種蛋白純化5～10次后，應(yīng)進(jìn)行strip和re-charge。3、柱的清洗與保存：a、去Ni離子：a、5×柱體積的StripBuffer（20mMTris-HCl,0.5MNaCl,50mMEDTA，pH7.4）洗滌；b、10×柱體積的去離子水洗滌。b、去沉淀的蛋白質(zhì)：a、5×柱體積的0.5MNaOH裝滿柱子，靜置0.5～2hr；b、去離子水洗滌，至流出液的pH值為7。c、保存：20％乙醇洗滌，再加20％乙醇保存于4℃。