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《蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)步驟》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)步驟（待改進(jìn)）1、取適當(dāng)相應(yīng)蛋白高表達(dá)的動(dòng)物組織提t(yī)otal-RNA。2、設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)引物。引物要去除信號(hào)肽，要加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)和保護(hù)堿基。3、RT-PCR，KOD酶擴(kuò)增獲取目的基因cDNA.4、雙酶切，將cDNA.克隆入PET28/32等表達(dá)載體。5、轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增，提質(zhì)粒。6、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株，挑菌檢測(cè)并保種。表達(dá)菌株如Bl21（DE3）、Rosettagami（DE3）、Bl21codon（DE3）等。7、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。1）將表達(dá)菌株在3mlLB培養(yǎng)基中搖至OD=0.6左
2、右，加入IPTG，濃度梯度從25μM到1mM。37度誘導(dǎo)過(guò)夜(一般3h以上即有大量表達(dá))。2）SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。注：目的蛋白包涵體表達(dá)量一般會(huì)達(dá)到菌體蛋白的50%以上，在膠上可以看到明顯的粗大的條帶。3）將有表達(dá)的菌株10%甘油保種，保存1ml左右就足夠了，并記錄IPTG濃度范圍。甘油是用0.22μm過(guò)濾除菌的，儲(chǔ)存濃度一般是30%-60%，使用時(shí)自己計(jì)算用量。4）用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導(dǎo)10ml表達(dá)菌，18度，低轉(zhuǎn)速（140-180rpm），誘導(dǎo)過(guò)夜作為包涵體檢測(cè)樣品。注意：1.如果
3、表達(dá)的蛋白對(duì)菌體有毒性，可以在加IPTG之前的培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖用來(lái)抑制本底表達(dá)。葡萄糖會(huì)隨著細(xì)菌的繁殖消耗殆盡，不會(huì)影響后面的表達(dá)。2.保種可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反復(fù)凍融。8、包涵體檢測(cè)。方案見(jiàn)附件29、如有上清表達(dá)，則擴(kuò)大搖菌。1）取保種的表達(dá)菌株先搖10ml，37度，300rpm搖至OD>=1.5，約5h左右，視菌種的活性而異，也可過(guò)夜搖菌。2）將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37度，250rpm搖至OD=1.0左右（約2.5h~3h），然后加IPTG（濃度同包涵體檢測(cè)中使
4、用的濃度。）注：菌液濃度要適當(dāng)?shù)臐庖恍?，否則第二天收集不到足夠的菌體，因?yàn)榈蜏氐娃D(zhuǎn)速細(xì)菌生長(zhǎng)非常緩慢。拿起錐形瓶對(duì)光搖動(dòng)，看到有大量云霧狀菌體即可。另一方法是，將手指放在瓶底晃動(dòng)，看不清手指為宜，不過(guò)此法宜受氣泡影響。3）過(guò)夜搖菌，使用包涵體檢測(cè)的溫度（18°左右），轉(zhuǎn)速140rpm左右。4）將菌液6000rpm，4min，4度離心收集菌體。加入20mMPBS，洗一遍后用平衡緩沖液重懸。每250ml菌液用30ml到50ml平衡緩沖液，視菌液的濃度而定。可用4支50ml的離心管同時(shí)離心，但是，離心管要重復(fù)使用，用完后洗
5、凈保存。10、超聲波裂解。1）用6mm變幅桿，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。注意：1.要冰浴。2.要隨時(shí)觀察裂解情況以防意外。3.要將探頭探入到溶液中下部，盡量不要打出大量氣泡。一般溶液量比較大的時(shí)候不會(huì)出現(xiàn)大量氣泡。4.正常聲音為：孜孜聲，尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對(duì)或者功率太大或者探頭松動(dòng)等原因，要及時(shí)調(diào)整。溶液由渾濁變清透，由粘稠變不粘稠表明裂解完成（后面3000轉(zhuǎn)離心時(shí)，如果沉淀少說(shuō)明裂解的好）。5.超聲波破碎儀工作30分min要休息5min（即關(guān)閉總電源開(kāi)關(guān)）。注意：1.如果純化的蛋
6、白較易被蛋白酶降解，在超聲裂解之前要加蛋白酶抑制劑（PMSF），PMSF工作濃度為1%。2.如不能判斷是否裂解完全，就按上述條件裂解60分鐘，60分鐘足夠裂解。1、取得上清1）將破碎好的溶液收集到50ml離心管中。10000rpm，15min，4°離心。沉淀為包涵體、細(xì)胞碎片和未破碎的細(xì)胞。輕輕的將上清倒出，盡量不要倒出沉淀。（此時(shí)可以測(cè)量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就會(huì)在7.5左右。）2、純化上清---摸洗脫條件。1）鎳柱處理。將1ml鎳柱吸入空層析管中，待其中
7、的液體流完后加入平衡緩沖液3ml。2）將10ml上清加到已經(jīng)平衡過(guò)的NI柱上，并將過(guò)柱的樣品重復(fù)上樣3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一個(gè)針頭，或者用1ml的槍將膠體吹散。）取20μl過(guò)柱后的樣品，以備跑膠。3）分別加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度來(lái)洗脫雜蛋白。每個(gè)梯度分別的上樣量為4ml、2ml、2ml、2ml。每個(gè)次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP管中，以備跑膠。注意：理論上是要將收集的溶液測(cè)量280nm處的吸光度，直到吸光度為零時(shí)再進(jìn)行下一個(gè)梯度的洗脫。實(shí)際上測(cè)不到零，怎么都會(huì)
8、有一點(diǎn)的，上面說(shuō)的量已經(jīng)做夠洗脫了。4）加ElutionBuffer將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml（將前面的0.5ml單獨(dú)接入EP管，再將后面的4ml接入另外兩個(gè)EP管），留跑膠樣品。5）加MES將NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10mlMiliqH2O。流完后保存于2倍體積的20%乙醇中，鎳柱至少能重復(fù)利用6次。（尿素可能對(duì)NI柱
