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1、環(huán)孢素A血藥濃度HPLC測定方法 【摘要】目的：建立環(huán)孢素A血藥濃度的HPLC測定方法。方法：采用反相HPLC的方法，血樣經(jīng)乙醚萃取，正己烷洗脫等處理后測定。采用DiamonsilTMC18色譜柱，流動相為乙腈-水（74：26，V/V），流速為1ml/min，柱溫為70℃，檢測波長為210nm。結(jié)果：環(huán)孢素A血藥濃度在50～1000ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.9997，低中高三種濃度的提取回收率為70.01%～75.00%，方法回收率為98.93%～103.08%，日內(nèi)精密度RSD為0.84%～4.
2、76%，日間精密度RSD為5.38%～9.87%。結(jié)論：該方法快速靈敏準確，可用于環(huán)孢素A血藥濃度的監(jiān)測?！娟P(guān)鍵詞】環(huán)孢素A；高效液相色譜；血藥濃度監(jiān)測環(huán)孢素A（CyclosporineA，CsA）是一種強效免疫抑制劑，目前廣泛用于器官和組織移植術(shù)后的預(yù)防和治療[1]。然而CsA治療的有效血藥濃度范圍為100～450μg/L，600μg/L以上即有中毒危險[2]，特別是肝腎毒性明顯[3]。CsA治療窗窄，個體差異大，因此，臨床應(yīng)用必須監(jiān)測其血藥濃度。本實驗建立了一種簡單準確的HPLC測定CsA血藥濃度的方法，現(xiàn)報
3、告如下。1材料與方法1.1儀器與試劑CsA6標準品，乙醚，正己烷，甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），Agilent1200型高效液相色譜儀，DiamonsilTMC18色譜柱，GENIUS6K-D離心機，XW-80A漩渦混合儀。1.2標準溶液的配制精密稱取CsA標準品10.006mg置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，作為CsA標準品儲備（100μg/mL）。用甲醇稀釋，分別配成2.5、5、10、25、50μg/ml的CsA標準品溶液。1.3樣品的處理1.3.1空白血樣取人全血1～10ml均塞離心管中，加入1m
4、l0.1mol/L的NaOH溶液，渦旋2min，加入5ml乙醚，渦旋5min，3500r/min離心10min，取上清液4.5ml，40℃水浴吹干，加入100μl甲醇-0.05mol/ml鹽酸（1：1，V：V）的混合液[4]，渦旋30s，加入250μl正己烷，渦旋2min，3500r/min離心5min，棄去正己烷，取下層溶液進樣。1.3.2加藥血樣取濃度為2.5、5、10、25、50μg/mL的CsA標準溶液各20μl置10ml均塞離心管中，分別加入人全血1ml，配置成含CsA50、100、200、500、10
5、00ng/ml血液樣品，加入1ml0.1mol/L的NaOH溶液，后處理方法同“1.3.1”項下空白血樣。1.4色譜條件的選擇色譜柱：DiamonsilTM6C18（4.6×200mm，5μm）；流動相：乙腈-水（74：26）；流速：1ml/min；柱溫：70℃；檢測波長：210nm；進樣量：20μl。1.5方法專屬性在上述色譜條件下，分別取CsA標準液，空白血樣，加藥血樣進行HPLC測定，考察其色譜圖。1.6標準曲線的制備取血藥濃度為50、100、200、500、1000ng/ml加藥樣品進行HPLC測定，以藥
6、物濃度C與樣品峰（A）做線性回歸，制備標準曲線。1.7回收率配制濃度分別為50、200、1000ng/ml的加藥血樣，按照“1.3.1”項下的處理方法處理、測定，分別與同濃度的CsA標準溶液直接進樣的峰面積做比較，計算提取回收率即絕對回收率。配制濃度分別為50、200、1000ng/ml的加藥血樣，按照“1.3.1”項下的處理方法處理、測定，按：“方法回收率=測得量/理論值×100%”計算方法回收率即相對回收率。1.8精密度濃度分別為50、200和1000ng/ml的加藥血樣按照“1.3.1”項下的處理方法處理，
7、測定，一日內(nèi)重復(fù)操作5次，考察其日內(nèi)精密度。在隨后的5d內(nèi)，重復(fù)操作5次，考察其日間精密度。2結(jié)果2.1方法專屬性CsA色譜圖考察結(jié)果如圖1所示，可見CsA的保留時間為7.66min左右，空白血樣在此時間點無干擾，CsA與血液中的內(nèi)源性物質(zhì)分離良好。2.2標準曲線及線性范圍結(jié)果如圖2所示，所得標準曲線為：A=0.0983C-1.629，R2=0.9997。2.3回收率低、中、高濃度的加藥血樣的提取與方法回收率見表1。低、中、高濃度的加藥血樣的日內(nèi)與日間精密度見表2。3討論個體化給藥是臨床用藥的發(fā)展趨勢，血藥濃度監(jiān)
8、測是臨床藥學(xué)的重要任務(wù)，因此，建立高效準確，經(jīng)濟適用的CsA血藥濃度監(jiān)測方法意義重大。HPLC法已普遍應(yīng)用于CsA血藥濃度的測量[5]，其優(yōu)點是靈敏快速，缺點是樣品處理繁瑣復(fù)雜，對操作人員要求高。另外，70℃高溫使色譜柱使用壽命縮短[6]，經(jīng)濟成本增加，但相比免疫學(xué)方法，如單克隆、多克隆熒光偏振免疫法[7-8]，酶免疫增強法[9]，MAb親和柱免疫測定法[10]等仍較經(jīng)濟
