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1、黑皮質(zhì)素4型受體在神經(jīng)病理性疼痛中的作用青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科褚海辰引言神經(jīng)病理性疼痛的形成機(jī)制神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞引言一直以來，“神經(jīng)元論”在神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制的研究中占據(jù)了統(tǒng)治地位。近年來，對星形膠質(zhì)細(xì)胞的深入研究表明，其細(xì)胞膜上存在著大量離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)的受體，且其激活后能夠產(chǎn)生和釋放多種神經(jīng)活性物質(zhì)，在慢性疼痛的發(fā)展過程中起著重要的作用。引言外周神經(jīng)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞激活可能是疼痛神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、趨化因子如EAAs、ATP、P物質(zhì)、CGRP、NO、PGs、fractalking？HS014是一種選擇性4-
2、型黑皮質(zhì)素受體(MC4R)拮抗劑。近年來研究表明，黑皮質(zhì)素肽類（MC）參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)，且其主要是通過MC4R實(shí)現(xiàn)的。引言引言研究表明，在多種神經(jīng)病理性疼痛實(shí)驗(yàn)中，外周或中樞（包括鞘內(nèi)和腦室內(nèi)）給予MC4R激動(dòng)劑α-MSH和ACTH可致痛覺過敏。而其拮抗劑HS014和SHU9119則可產(chǎn)生抗痛覺過敏作用。引言MC4R神經(jīng)病理性疼痛具體機(jī)制？引言隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛中的重要作用的認(rèn)識(shí)，且神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞既表達(dá)MC4R也分泌其內(nèi)源性激動(dòng)劑α-MSH。引言神經(jīng)病理性疼痛MC4R調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性以及
3、促炎性因子的表達(dá)推測：為了證明以上推測：我們分別從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平在脊髓和腦（主要是中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì),PAG）兩個(gè)部位對MC4R在膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其傷害性物質(zhì)的釋放中的作用進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分兩部進(jìn)行：實(shí)驗(yàn)一：從細(xì)胞方面研究了黑皮質(zhì)素4型受體在大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放興奮性氨基酸中的作用實(shí)驗(yàn)二：從動(dòng)物水平研究了中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）4型黑皮質(zhì)素受體在慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷引起膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性因子分泌中的作用觀察MC4R拮抗劑HS014對對腫瘤壞死因子α(TNF-α)激活的脊髓AST和嗎啡慢性處理的脊髓AST釋
4、放EAA的影響，以期闡明HS014在抑制疼痛和嗎啡耐受與戒斷反應(yīng)過程中可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)一第一部分：脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及鑒定第三部分：HS014對被激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放興奮性氨基酸的影響第二部分：高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法檢測興奮性氨基酸釋放第四部分：HS014對嗎啡慢性處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸的影響主要研究內(nèi)容實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1-2天新生Wistar大鼠，每批3-5只，清潔Ⅱ級(jí)。主要試劑DMEM/F12Hyclone公司，美國胰蛋白酶SIGMA公司，美國Neurobasal無血清培
5、養(yǎng)液Gibco公司，美國B27神經(jīng)營養(yǎng)生長因子Gibco公司，美國10%特優(yōu)胎牛血清民海生物工程有限公司單克隆兔抗鼠GFAP抗體武漢博士德生物工程有限公司封閉用正常山羊血清北京中杉FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG北京中杉多聚賴氨酸Sigma公司，美國谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品Dr.Ehrenstorfer公司，德國天門冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)品Dr.Ehrenstorfer公司，德國乙腈Merk公司，色譜純試劑醋酸銨ACROS公司，分析純試劑納洛酮Sigma公司，美國嗎啡沈陽第一制藥廠腫瘤壞死因子（TNF-α）Peptotech公司，美國HS014Pho
6、enixPharmaceutical公司，美國脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)的Wistar大鼠脊髓AST接種后，細(xì)胞貼壁很固，突擊光滑粗大，胞體較大，胞質(zhì)較豐富，形狀不規(guī)則，折光性差，細(xì)胞邊界清楚，隨著細(xì)胞數(shù)目增多細(xì)胞間相互交叉呈網(wǎng)狀，但細(xì)胞立體性不強(qiáng)，所以鏡下層次感不強(qiáng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定細(xì)胞高表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白—(GFAP)，發(fā)綠色熒光，藍(lán)光是DAPI復(fù)染的細(xì)胞核。HPLC-MS/MS方法檢測EAA建立了一種快速測定星形膠質(zhì)細(xì)胞上清中興奮性氨基酸釋放的高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（HPLC-MS/
7、MS）方法。使用高效液相-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式快速測定星形膠質(zhì)細(xì)胞（AST）興奮性氨基酸（EAAs）的釋放量。按照擬定的檢測方法，檢測結(jié)果如下：圖1混合對照品TIC(1-天門冬氨酸，2-谷氨酸)HS014對被激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放興奮性氨基酸的影響組別谷氨酸天門冬氨酸C組3.105±0.5310.336±0.047T組10.133±0.823*1.184±0.091*TH0.1組6.921±0.777#0.720±0.093#TH1組2.912±0.4333#0.427±0.053#TH10組2.28
8、5±0.375#0.237±0.029#與C組比，*P＜0.01，與T組比，#P＜0.01表2各組細(xì)胞興奮性氨基酸的釋放量（μmol/L，n=6，±s）HS014對被激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放興奮性氨基酸的影響采用液相質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）檢測上清液中興奮性氨基酸的含量結(jié)果見表2,與C組比較，T組Glu和As
