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《綠色熒光蛋白分子實(shí)驗(yàn).ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、綠色熒光蛋白報(bào)告基因的克隆基本原理：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是DNA的體外酶促擴(kuò)增。是利用兩個(gè)短的單鏈引物，在體外快速擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。應(yīng)用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過(guò)雙鏈DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復(fù)循環(huán)，使目的DNA片段在一定時(shí)間以指數(shù)方式增加百萬(wàn)倍。1.PCR擴(kuò)增獲得目的基因1、dNTP的質(zhì)量與濃度——dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。2、模板（靶基因）核酸——模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。3、Mg2
2、+濃度——Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。4、退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。5、變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。6、循環(huán)數(shù)——過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。影響因素：7、酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致
3、假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。8、引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增。9、變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。10、靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染
4、，導(dǎo)致假陽(yáng)性；二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果pcr擴(kuò)增獲得目的基因的凝膠電泳圖PCR產(chǎn)物引物模板跑膠條帶幾乎看不到?；驹恚篋NA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。注意事項(xiàng)及影響因素：1.對(duì)于瓊脂糖
5、凝膠電泳，濃度通常在0.5~2%之間，低濃度的用來(lái)進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來(lái)進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。2、凝膠電泳回收目的基因2、電泳時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。3、注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去
6、除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。4、注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對(duì)DNA樣品加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。5、正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號(hào)弱甚至缺失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果條帶清晰。PCR產(chǎn)物回收的檢驗(yàn)電泳圖。原理：在Mg2和ATP存在下，T4DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端聯(lián)接成重組DNA分子。影響DNA連接反應(yīng)的因
7、素：1、連接緩沖液的影響：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過(guò)稀而造成酶的失活。2、連接溫度與時(shí)間的影響：因?yàn)轲ば阅┒说腄NA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過(guò)高會(huì)使氫鍵不穩(wěn)定，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16℃，時(shí)間為4-16h?，F(xiàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于一般的黏性末端來(lái)說(shuō)，低溫連接較長(zhǎng)的時(shí)間可取得較好的連接效果。3、目的基因與載體的連接3、酶濃度的影響：日常
8、使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時(shí)酶用量要比連接黏端大10-100倍。4、DNA濃度的影響：要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物，DNA濃度不可過(guò)高，一般不會(huì)超過(guò)20nmol/L。要求線性化的連接產(chǎn)物，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。實(shí)驗(yàn)原理：轉(zhuǎn)化(Transformation)是將異源DNA分子引入另一原核細(xì)胞，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物、分子遺傳、基因工程等研究的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。感受態(tài)細(xì)胞：在自然條件下
