蒽酮比色法測總糖.doc

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1、蒽酮比色法測總糖實驗五總糖的測定——蒽酮比色法一、目的：1.掌握蒽酮法測定可溶性糖含量的原理和方法。2.學習植物可溶性糖的一種提取方法。二、原理：糖類在較高溫度下可被濃硫酸作用而脫水生成糠醛或羥甲基糖醛后，與蒽酮(C14H10O)脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍綠色。該物質在620nm處有最大吸收，在150μg/ml范圍內，其顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。這一方法有很高的靈敏度，糖含量在30μg左右就能進行測定，所以可做為微量測糖之用。一般樣品少的情況下，采用這一方法比較合適。三、儀器、試劑和材料1.儀器：電熱恒溫水浴鍋，分光光度計，電子天平，容量瓶，刻度吸

2、管等2.試劑：(1)葡萄糖標準液：l00μg/ml(2)濃硫酸(3)蒽酮試劑：0.2g蒽酮溶于100ml濃H2SO4中。當日配制使用。3.材料：甜糜秸稈四、操作步驟1.葡萄糖標準曲線的制作取7支大試管，按下表數據配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液：管號1234567葡萄糖標準液（ml）00.10.20.30.40.60.8蒸餾水（ml）10.90.80.70.60.40.2葡萄糖含量（μg）0102030406080在每支試管中立即加入蒽酮試劑4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準確煮沸l(wèi)0min取出

3、，用冰浴冷卻至室溫，在620nm波長下以第一管為空白，迅速測其余各管吸光值。以標準葡萄糖含量（μg）為橫坐標，以吸光值為縱坐標，作出標準曲線。2.植物樣品中可溶性糖的提?。簩悠芳羲橹?mm以下，105oC烘干至恒重，精確稱取1~5g，置于50ml三角瓶中，加沸水25m1，加蓋，超聲提取10min，冷卻后過濾（抽濾），殘渣用沸蒸餾水反復洗滌并過濾（抽濾），濾液收集在50m1容量瓶中，定容至刻度，得提取液。3.稀釋：吸取提取液2m1，置于另一50m1容量瓶中，以蒸餾水稀釋定容，搖勻。4.測定吸取1ml已稀釋的提取液于試管中，加入4.Oml蒽酮試劑，平行三份；空白

4、管以等量蒸餾水取代提取液。以下操作同標準曲線制作。根據A620平均值在標準曲線上查出葡萄糖的含量（μg）。五、結果處理C×V總×D樣品含糖量（%）=─────────────×100W×V測×106其中：C——在標準曲線上查出的糖含量（μg），V總——提取液總體積（ml），V測——測定時取用體積（ml），D——稀釋倍數，W——樣品重量（g），106——樣品重量單位由g換算成μg的倍數六、注意事項：該法的特點是幾乎可測定所有的碳水化合物，不但可測定戊糖與已糖，且可測所有寡糖類和多糖類，包括淀粉、纖維素等（因為反應液中的濃硫酸可把多糖水解成單糖而發(fā)生反應），所以用

5、蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應用價值，但在測定水溶性碳水化合物時，則應注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應液中，否則會因為細胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時則可避免此種誤差。七、思考題：1.用水提取的糖類有哪些？2.制作標準曲線時

6、應注意哪些問題？