毛花獼猴桃‘贛獼6號(hào)’葉綠素合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.docx

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1、毛花獼猴桃‘贛獼6號(hào)’葉綠素合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析毛花獼猴桃是我國特有資源,具有豐富的抗氧化物質(zhì)、高含量抗壞血酸等營養(yǎng)成分,花和果實(shí)均有很強(qiáng)的觀賞性,果實(shí)易剝皮,抗逆性強(qiáng),具有廣闊的開發(fā)利用前景。目前,獼猴桃果肉顏色越來越受到重視,毛花獼猴桃果肉碧綠色,但其相關(guān)呈色分析的研究鮮見報(bào)道。本文以綠肉型毛花獼猴桃‘贛獼6號(hào)’為研究材料,進(jìn)行果肉色度、葉綠素(Chlorophyll,Chl)、類胡蘿卜素(Carotenoid,Car)、葉綠素/類胡蘿卜素(Chl/Car)的測定及各指標(biāo)間的相關(guān)性分析,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)Chl合成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測,并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行克

2、隆與表達(dá)分析,以期為闡明毛花獼猴桃果肉色澤發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),亦為獼猴桃分子育種與種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.整個(gè)果實(shí)發(fā)育階段(盛花后20-170d)果肉色度穩(wěn)固上升;Chl含量在盛花后95d之前基本維持在6mg/100g,在盛花后140d快速上升至整個(gè)時(shí)期最大值(9.20mg/100g);整個(gè)過程中Chla(葉綠素a)含量所占比重顯著高于Chlb(葉綠素b);Car含量在盛花后110d之前表現(xiàn)穩(wěn)定,后期先上升再下降,于盛花后140d達(dá)到最大值(2.63mg/100g);Chl和Car均與Chla、Chlb、色度呈極顯著相關(guān)性,且二者之間亦呈極顯著相關(guān)。說明

3、整個(gè)果實(shí)發(fā)育階段高含量的Chl是毛花獼猴桃果肉持續(xù)呈現(xiàn)綠色的原因。2.基于前期色素含量分析結(jié)果,選取6個(gè)重要時(shí)期提取果肉RNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)‘贛獼6號(hào)’果肉Chl合成相關(guān)的12個(gè)差異基因進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明,各基因表達(dá)水平各不相同;相關(guān)性分析顯示Chl含量僅與基因Unigene25176的相對(duì)表達(dá)量呈極顯著相關(guān),而Unigene25176與其他11個(gè)基因無相關(guān)性;聚類分析結(jié)果顯示,基因Unigene25176在Chl合成中最高水平表達(dá),且單獨(dú)聚成一類,與其他基因明顯不同。綜合分析表明,Unigene25176可能是Chl合成的關(guān)鍵基因?；騏nigene251

4、76被注釋為預(yù)測編碼葡萄中生色團(tuán)的鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶基因(ferredoxin-NADP+oxidoreductase,FNR)。光敏色素不僅通過對(duì)植物激素以及其他化學(xué)成分的調(diào)節(jié)作用來影響植物的形態(tài),而且還調(diào)控基因表達(dá)。FNR是存在類囊體膜表面的蛋白質(zhì),主要催化電子從還原態(tài)的鐵氧還蛋白(ferredoxin,FD)傳遞給NADP+,生成的NADPH主要作用于卡爾文循環(huán)中CO2的固定、氮同化和Chl合成等其他反應(yīng)。3.利用基因克隆和RNA-Seq測序技術(shù)對(duì)綠肉型毛花獼猴桃‘贛獼6號(hào)’中Chl合成的候選關(guān)鍵基因Unigene25176進(jìn)行克隆,研究結(jié)果表明:Unige

5、ne25176包含1個(gè)885bp開放閱讀框,編碼294個(gè)氨基酸,同源進(jìn)化樹顯示該基因與同為漿果類的葡萄遺傳距離最近,同源蛋白氨基酸序列比對(duì)相似度達(dá)65.45%,與擬南芥距離最遠(yuǎn)。分析其蛋白保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)屬于Fe_bilin_red超家族,與FNR有關(guān),可確定其是Chl合成的關(guān)鍵候選基因。