黃芩苷對小鼠哮喘模型的炎性細(xì)胞的影響

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1、黃芩苷對小鼠哮喘模型的炎性細(xì)胞的影響試驗設(shè)計試驗材料：試驗動物：健康BALB/c小鼠60只，雌性，6-8周齡，體重18-22g。小鼠隨機(jī)分成6組：正常對照組、模型組、地塞米松陽性對照組及黃芩苷高、中、低劑量組。試驗試劑：黃芩苷、卵清蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠、地塞米松、小鼠TL-4、IL-5、.1L-13、IL-17、IFN-γ細(xì)胞因子和小鼠抗OVA-IgEELISA試劑盒、脂多糖（LPS）、過碘酸—雪夫反應(yīng)試劑盒、RT-PCR試劑盒、乙酰甲膽堿等主要儀器：試驗方法：建模：①嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘模型模型組、陽性對照組及黃芩苷高、中、低

2、劑量組小鼠分別于第1、7、15天腹腔注射OVA溶液0.2mL(含OVA20μｇ、氫氧化鋁1ｍｇ),于實驗第21天起將小鼠置于密閉容器內(nèi),予2%OVA生理鹽水霧化激發(fā),1次/天,每次30min,連續(xù)7ｄ,以呼吸急促深快、煩躁嗆咳及點頭運(yùn)動等癥狀的出現(xiàn)為激發(fā)成功;正常對照組:于第1、7、15天以生理鹽水代替OVA溶液給小鼠腹腔注射(0.2ｍＬ),第21天起以生理鹽水進(jìn)行霧化激發(fā)。其余同前。②中性粒細(xì)胞性哮喘模型小鼠致敏：于實驗第1天、7天和15天分別致敏，共三次。方法：每只小鼠用1%戊巴比妥鈉溶液50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，使其頸部豎

3、直，用移液器取10μgLPS經(jīng)鼻逐滴滴入，利用小鼠呼吸將致敏液吸入氣道，左右鼻孔交替進(jìn)行并于腹腔內(nèi)注入OVA50μg。小鼠激發(fā)：從實驗第21天起，將哮喘組小鼠置于自制小鼠霧化吸入箱中，用5%OVA溶液進(jìn)行霧化吸入激發(fā)，每天霧化30min，連續(xù)霧化2周給藥方法：自實驗第21天起,在OVA溶液霧化攻擊前1ｈ給予相應(yīng)藥物。黃芩苷高、中、低劑量組分別灌胃給予黃芩苷90、30、10mg/kg(灌胃容積25ml/kg);陽性對照組小鼠灌胃給予地塞米松1.0mg/kg;正常對照組、模型組小鼠灌胃等容積生理鹽水,連續(xù)7ｄ(于第28天,即末次激發(fā)后24

4、ｈ處死小鼠)。標(biāo)本收集：小鼠血清：末次激發(fā)后24h,小鼠經(jīng)眼球采血。全血37℃靜置2h,4℃過夜,3000rpm離心l0min。收集血清樣本,用于測定血清中抗OVA特異性IgE表達(dá)水平。肺泡支氣管灌洗液：末次激發(fā)后24h,將小鼠麻醉腹部向上固定于蛙板,剪開皮膚,剝離氣管,用眼科剪將氣管剪適中小口,用磨平的15號針頭做氣管插管,將線繩穿過氣管底部,固定氣管與針頭。將0.5mL37℃生理鹽水緩慢注入其中,輕輕按壓胸部,然后回收置于離心管中,重復(fù)2次,使其回收率達(dá)80%。合并3次灌洗液。BALF中細(xì)胞因子測定：將BALF1500rpm離心1

5、0min,取上清液測定BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IFN-γ表達(dá)水平。按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定。BALF中炎性細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)：將BALF離心后細(xì)胞泥懸浮于1mLPBS,吸取20μL涂片、干燥、固定,進(jìn)行瑞士-姬姆薩染色,每板至少200個細(xì)胞。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類計數(shù),炎性細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、中性粒細(xì)胞（NEU）和巨噬細(xì)胞。肺病理組織切片的制作:末次激發(fā)后24h,小鼠眼球放血處死,剪小鼠皮膚,剖開胸腔,取出肺臟。將小鼠肺臟浸入10%福爾馬林固定,修整組織塊,常規(guī)石蠟包埋切片,進(jìn)行HE

6、染色,鏡檢觀察。過碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色觀察黃芩苷作用后,哮喘模型小鼠肺部病理學(xué)變化。RT-PCR:引物設(shè)計及合成?。?ｂｅｔ,上游,5′-ＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＧＣＴＴＡＴＡＴＧ-3′,下游,5′-ＧＡＣＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＡＴＴＧＴ-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物136ｂｐ;ＧＡＴＡ-3,5′-ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧ-3′,下游,5′-ＧＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣ-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物408ｂｐ;ＳＴＡＴ-6,上游,5′-ＣＡＣＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＴＡＴ-3′,下游,5′-ＣＴＧＡＡＴ

7、ＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＣＣ-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物361ｂｐ;β-ａｃｔｉｎ,上游,5′-ＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣ-3′,下游,5′-ＣＡＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧ-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物491ｂｐ。趨化因子：Th1：CXCR3、CCR5Th2：CCR3、CCR4、CCR8氣道阻力、AHR測定:于霧化第1、7、14天釆用Buxco小鼠肺功能儀(FinePointeTMSeriesRCSite)檢測小鼠總氣道阻力。l%OVA霧化完畢后立即予1%戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉小鼠,切開皮膚,鈍性分離皮下組織、肌肉,充分暴露氣管,眼

8、科剪剪開一個小口,取18GBuxco小鼠氣管插管置入氣管中行有創(chuàng)氣管插管術(shù);預(yù)熱加熱板至37℃,連接小鼠肺功能測量儀,將小鼠置于密體描恒溫箱加熱板上,呼吸機(jī)輔助呼吸,呼吸頻率140次/min,潮氣量0.25ml,先測定小