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1、豬瘟疫苗毒與野外毒抗原性之差異潘居祥 鍾明華 黃金城 黃天祥 楊喜金 李淑慧 林士鈺行政院農(nóng)業(yè)委員會家畜衛(wèi)生試驗(yàn)所摘 要本試驗(yàn)係從病毒性狀及胺基酸序列差異上，探討豬瘟疫苗毒與野外毒兩者抗原性之差異。從一豬瘟病毒七種不同的限制酶圖譜中選取36株野外分離毒，採用新城病毒增強(qiáng)法(END)及E干涉一法測定病毒性狀。結(jié)果出現(xiàn)34株以END法呈陽性屬於強(qiáng)毒株，2株以E干涉法呈陽性屬於弱毒株。應(yīng)用病毒斑點(diǎn)性狀測定法(IIPS)，依病毒斑灶大小可清楚區(qū)別LPC疫苗毒及ALD強(qiáng)毒株所產(chǎn)生之病毒斑灶，但不同野外毒病毒斑灶則出現(xiàn)大小不一的現(xiàn)象。
2、另將LPC疫苗毒及ALD強(qiáng)毒株病毒核酸中，與中和抗體產(chǎn)生有關(guān)的E0、E1及E2醣蛋白基因(2,235bp)進(jìn)行核酸定序，並將核酸序列轉(zhuǎn)譯成胺基酸序列，共可轉(zhuǎn)換成745個(gè)胺基酸。比較兩者胺基酸總體相似性高達(dá)94.7﹪，但在胺基酸序列471及480之間大約在E2醣蛋白Bdomain位置出現(xiàn)高度變異，此區(qū)間10個(gè)胺基酸序列中即出現(xiàn)高達(dá)6個(gè)相異的胺基酸序列。一關(guān)鍵詞：豬瘟病毒關(guān)鍵詞：豬瘟病毒、新城病毒增強(qiáng)法：豬瘟病毒、新城病毒增強(qiáng)法、、新城病毒增強(qiáng)法、E干涉法、間接免疫酵素標(biāo)幟染色法干涉法、間接免疫酵素標(biāo)幟染色法、核酸、間接免疫酵素
3、標(biāo)幟染色法、核酸定序緒 言由於豬瘟病毒對各種品系和各階段年齡的豬隻都會感染，很難依毒性不同作毒株的分類，一般常依豬隻感染豬瘟後，臨床上呈現(xiàn)的各種嚴(yán)重程度及病程的長短，將豬瘟病毒的毒力區(qū)分成：強(qiáng)毒株、中間毒株和弱毒株。此三種病毒株與LPC疫苗毒之間抗原性差異有多大？現(xiàn)行LPC疫苗種毒已經(jīng)使用30多年，LPC疫苗毒對於各種豬瘟野外毒變異株能否具有完全保護(hù)效力則缺乏文獻(xiàn)資料。因此有必要探討豬瘟疫苗毒與野外毒兩者間抗原性之差異，並評估目前使用之LPC疫苗毒對於不同豬瘟野外毒之免疫效力，以做為LPC疫苗改良及豬瘟防疫之依據(jù)。目前從病
4、毒的分子生物學(xué)上很難區(qū)別豬瘟病毒的毒性強(qiáng)弱，有學(xué)者以豬瘟病毒在試管內(nèi)的培養(yǎng)特性來區(qū)別毒株的強(qiáng)弱。據(jù)VanOirschot[16]的說法，豬瘟強(qiáng)毒株的理想培養(yǎng)溫度是39~40C，弱毒株為33~34C，而中間毒株則介於強(qiáng)毒株和弱毒株之間為35~38C，強(qiáng)毒株的豬瘟病毒在PK-15細(xì)胞上的增殖速度較其它兩者來的快且力價(jià)高，以免疫螢光抗體染色法區(qū)別也發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒株的螢光較強(qiáng)且病灶較大[7]。此外，強(qiáng)毒株在56C溫度下的耐受性也較弱毒株和中間毒株強(qiáng)。Pirtle和35-5-1Mengeling[12]將分離自慢性豬瘟病例的病毒和抗強(qiáng)毒株的
5、免疫血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒對自家血清的中和反應(yīng)效力較不同源血清的反應(yīng)來得高，這表示強(qiáng)毒株與弱毒株之間的抗原性有所不同。所以VanOirschot[16]依血清中和試驗(yàn)的結(jié)果將豬瘟病毒分類為兩種亞群(subgroup)，第一種亞群是包含了豬瘟強(qiáng)毒株和已馴化的疫苗毒株，而第二種亞群是豬瘟弱毒株和中間毒株，其中以第二種亞群毒性較弱的豬瘟病毒在血清學(xué)上和牛的BVD病毒的關(guān)係較相近。潘[1]應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及限制酶片段多形性(RFLP)兩種技術(shù)已可將豬瘟野外毒區(qū)分為5種不同毒株。在病毒特性方面，豬瘟病毒以
6、組織培養(yǎng)細(xì)胞在試管(包括培養(yǎng)盤)中之毒性，可測得三一一種性狀，即以END法測出陽性者為強(qiáng)毒病毒，以E干涉法測出陽性者屬GPE型弱毒性病毒，一而以E二段法測出陽性病毒，係屬兔化豬瘟毒型病毒。顯示可利用此三種方法檢測野外分離毒[2]。豬瘟病毒基因具有一個(gè)開放讀碼區(qū)(Openreadingframe；ORF)[8]，其3'端不具poly-ATail，5'端和3'端各有一段非轉(zhuǎn)譯區(qū)5'-UTR與3'-UTR。豬瘟病毒基因在開放讀碼區(qū)轉(zhuǎn)譯出一段3,898個(gè)譯碼(codons)之多之(polypeptide)，此為病毒蛋白質(zhì)前驅(qū)物(pr
7、ecursorprotein)，在經(jīng)過病毒或宿主的酵素切割作用後才會形成成熟的病毒結(jié)構(gòu)性蛋白[14][17]。豬瘟病毒結(jié)構(gòu)性蛋白主要包含有nucleocapsidprotein(p14)及三種gp44/48(E0)、gp33(E1)、gp55(E2)之封套蛋白(envelopglycoprotein)[4]，其中以gp55(E2)研究最多也最早被定位，gp55含有豬瘟病毒主要抗原決定基(epitope)，亦為中和抗體產(chǎn)生之主要蛋白[9][19]，其文獻(xiàn)上記載病毒封套蛋白與抗原性最具有相關(guān)性。本試驗(yàn)即藉由核酸定序及胺基酸轉(zhuǎn)譯之
8、方法，嘗試從病毒封套蛋白胺基酸之序列差異上瞭解豬瘟強(qiáng)毒株(ALD)與兔化豬瘟疫苗毒(LPC)兩者在抗原性上之差異。材料與方法一一、一、、病毒、病毒來源1.ALD豬瘟強(qiáng)毒株：本株病毒用豬隻繼代保存，以發(fā)病豬之脫纖血作為病毒來源。2.LPC兔化豬瘟疫苗株：本試驗(yàn)使用者為經(jīng)家兔繼代第824代之病
