生物制品分析課件

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生物制品分析BiopharmaceuticalAnalysis彭金詠藥學(xué)院藥物分析教研室

1【基本要求】1．了解生化藥物和基因工程藥物定義、種類和特點(diǎn)。2．熟悉該類藥物的質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法。3．掌握常用的定量分析方法中的色譜分析法。返回

22005年版藥典分為幾部？每部的收載內(nèi)容？第一部：收載中藥材及飲片，植物油脂和提取物，成方制劑和單方制劑第二部：收載化學(xué)藥品、抗生素、生化藥品、放射性藥品及其制劑第三部：生物制品和《中國生物制品規(guī)范》，101種

3化學(xué)藥物Chemicaldrugs生物藥物Biopharmaceuticals中藥TraditionalChineseMedicineTCM第一節(jié)：概述

4生物藥物：是指利用生物體、生物組織或器官等，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)和藥學(xué)等原理與方法制得的一類藥物。生化藥物Biochemicaldrugs生物合成藥物Biosyntheticdrugs生物制品Biologicalproducts

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6生物合成藥物：利用現(xiàn)代生物技術(shù)研制的一類藥物，包括基因工程藥物?；蚬こ趟幬铮涸诖_定對某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，進(jìn)而控制該蛋白質(zhì)合成過程的基因進(jìn)行分離、純化或人工合成，利用重組DNA技術(shù)加以改造，最后將該基因?qū)肟梢源罅可a(chǎn)的受體細(xì)胞中，在受體中不斷繁殖和表達(dá)，進(jìn)而生產(chǎn)大規(guī)模具有復(fù)方和治療疾病的蛋白質(zhì)。

7生物制品：是應(yīng)用普通的生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及組織等生物材料制備用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。

8生化藥物和基因工程藥物的分類生化藥物氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)酶和輔酶類多糖類脂質(zhì)類藥物核酸及其降解產(chǎn)物

9基因工程藥物激素和神經(jīng)遞質(zhì)類胰島素、生長激素細(xì)胞因子類人干擾素、人白細(xì)胞素、促紅細(xì)胞生成素酶及凝血因子類單克隆抗體、基因藥物、反義核酸

10生物制品的種類和特點(diǎn)1、疫苗類藥物：細(xì)菌疫苗、病毒疫苗、聯(lián)合疫苗、多價(jià)疫苗2、抗毒素及抗血清類藥物：被動(dòng)免疫制劑3、血液制品4、重組DNA制品：細(xì)胞因子、生長因子、酶、抗體5、診斷制品6、其他制品

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14生化藥物和基因工程藥物的特點(diǎn)◆◆都是來自生物體或通過生物手段獲得◆分子量都較大幾十KD～幾千KD，不是固定值化學(xué)結(jié)構(gòu)式難以確認(rèn)，單單是光譜分析方法難以進(jìn)行◆在生產(chǎn)過程中需要全面的質(zhì)量控制在生產(chǎn)過程中要求進(jìn)行生物活性檢查往往需要進(jìn)行安全性檢查熱源、過敏、異常毒性、致突變、生殖毒性往往需要進(jìn)行效價(jià)（含量）測定◆◆◆

15生化藥物和基因工程藥物質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序于方法鑒別試驗(yàn)雜質(zhì)檢查安全性檢查效價(jià)測定

16鑒別試驗(yàn)理化鑒別試驗(yàn)化學(xué)反應(yīng)法光譜鑒別法－UV色譜鑒別法－HPLC生物化學(xué)鑒別法酶法電泳法等電點(diǎn)聚焦法生物鑒別法對比吸收光譜和特征吸收的一致性對比色譜保留行為的一致性第二節(jié)：鑒別實(shí)驗(yàn)

17鏈激酶理化鑒別▲

18高效液相色譜法：1、反相高效液相色譜法2、分子排阻色譜法毛細(xì)管電泳1、毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE

19重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的肽圖分析1、RP-HPLC條件：VydacC18(150×4.6,5μm)MP:0.1%CH3CF3-CH3CNingradientelutionFR:0.5ml/minDW:214nm

202、CZE條件：毛細(xì)管柱（37cm×75μm），有效長度：30cmBuffer:0.05mol/l的磷酸鹽水溶液（pH=5.8)運(yùn)行電壓：12KVDW：214nm

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22▲生化鑒別

23雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)檢查安全性檢查第三節(jié)：雜質(zhì)檢查

24特殊雜質(zhì)檢查1、宿主細(xì)胞蛋白殘留量的檢查目的：控制異源蛋白的含量以防超量后引起機(jī)體免疫反應(yīng)測定法：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法－ELISA2、外源性DNA殘留量的檢查目的：防止外源性DNA對人類的危害測定法：分子雜交技術(shù)、基于DNA結(jié)合蛋白分析系統(tǒng)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

253、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的檢查－同系物、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物等測定法：HPLC和CE4、殘余抗生素的檢查目的：控制生物制品制備時(shí)抗生素的用量測定法：抑菌試驗(yàn)

26安全性檢查常規(guī)熱源和細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查異常毒性試驗(yàn)過敏試驗(yàn)降壓物質(zhì)試驗(yàn)無菌試驗(yàn)一些特殊污染物的檢查致突變試驗(yàn)生殖毒性試驗(yàn)

27異常毒性試驗(yàn)：是用一定劑量的藥物按照指定的操作方法和途徑給予規(guī)定體重的某試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其極性毒性反應(yīng)。小鼠、LD50過敏試驗(yàn)：是對生化藥物和基因工程藥物中的異性蛋白進(jìn)行進(jìn)檢查。豚鼠、皮膚過敏和腹腔注射降壓物質(zhì)檢查：檢查藥物中能夠?qū)е卵獕航档偷奈镔|(zhì)，如組胺類。貓或狗

28無菌檢查：對于不能進(jìn)行高溫滅菌的生物藥品，必須進(jìn)行無菌檢查。一些特殊污染物的檢查：主要考慮外源性DNA、一些雜蛋白等。致突變試驗(yàn)：回復(fù)突變試驗(yàn)、染色體畸變試驗(yàn)等生殖毒性試驗(yàn)

29含量測定HPLCSDS-PAGEUVorFlueserence效價(jià)測定第四節(jié)：含量（效價(jià)）測定

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33常用的定量分析方法及應(yīng)用理化分析法生化分析法生物檢定法

34理化分析法化學(xué)分析方法電化學(xué)分析法光譜分析法色譜分析法重量法容量分析法

35重量法：根據(jù)樣品中分離出來的單體或化合物的重量測定所含成分的含量的方法。提取法：用適宜的溶劑提取樣品中的某成分后揮去溶劑進(jìn)行測定的方法。揮發(fā)法：利用被測組分的揮發(fā)性，或經(jīng)過衍生化后將其轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性物質(zhì)來進(jìn)行測定的方法。沉淀法：將被測組分轉(zhuǎn)化成沉淀，稱定沉淀的重量來計(jì)算含量的方法。

36比色法利用樣品與顯色劑發(fā)生現(xiàn)色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色強(qiáng)度來測定含量。Elson-Morgan硫酸軟骨素的比色法測定：在酸性條件下使樣品水解成氨基己糖，再在堿性條件下與乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在525nm處有最大吸收。光譜分析方法

37具體試驗(yàn)操作：1、制備對照品溶液－氨基葡萄糖2、制備供試品溶液－硫酸軟骨素3、反應(yīng)和測定－縮合反應(yīng)和比色測定A平為供試品溶液的吸收度As平為對照品溶液的吸收度Ws為對照品溶液的濃度（mg/ml）W為稱樣量（mg）0.8309為校正因子500為稀釋倍數(shù)以氨基葡萄糖計(jì)≥24.0％

38高效液相色譜法反相高效液相色譜法RP-HPLCReversed-phasehigh-performanceliquidchromatography高效離子交換色譜法HPIECHigh-performanceIon-exchangechromatography高效凝膠過濾色譜法HPGFCHigh-performanceGel-filterchromatography

39反相高效液相色譜法基本原理：利用ODS或C18等極性較小的鍵合硅膠為填料，以極性較大的methanol-water、CH3CN-H2O為流動(dòng)相，根據(jù)樣品在固定相和流動(dòng)相中的不同保留行為而實(shí)現(xiàn)高效分離的一種方法?？梢詰?yīng)用UV、DAD、FD、ELSD、ECD、MS等作為檢測器，分離化合物范圍廣泛。

40DeterminationofAAsbyRP-HPLCwithpre-columnderivationtechniqueChromatographicconditionsColumn(BeckmanUltrasphereRP-C18(250×4.6mm,I.D.,5μm)Mobile-phase:0.05%TFA(A)and乙腈-異丙醇（4：1），梯度洗脫。Flowrate:1.2ml/minColumntemperature:48℃Detector:FD280nm/430nm

41測定樣品的制備：取肽樣品－置于水解管中－加內(nèi)標(biāo)－加鹽酸－水解－干燥－溶解（NaHCO3和EDTA)－加反應(yīng)液（丹酰氯）－再加NaOH水解丹酰氯－進(jìn)樣分析

42生白能的RP-HPLC測定色譜條件色譜柱：TSKODS-120T(150×4.6mm,I.D.,5μm)流動(dòng)相:（A）0.1％的三氟乙酸,（B）乙腈－1％三氟乙酸（90：10），梯度洗脫檢測波長：214nm柱溫：室溫流速：1.0ml/min

43生白能添加劑

44日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀；分析柱為2619陽離子交換樹脂柱（2.6mm×150mm）；柱55℃，緩沖液流速0.225ml／min，茚三酮檢測，流速0.3ml／min，進(jìn)樣量50μl。分析方法的重復(fù)性變異系數(shù)<2.5％，各種氨基酸的回收率平均為95％。核桃仁中氨基酸的HPLC分析測定

45取核桃仁粉碎過60目篩，精密稱取200mg，加6mol/L鹽酸5ml于玻璃小管中，充氮?dú)夂笕鄯猓?10℃水解18h，用4mol/LNaOH調(diào)pH值至中性，用0.02mol/L鹽酸稀釋至50ml，過0.45μm微孔過濾膜，為總氨基酸分析用樣品液。

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48用HPLC法和氨基酸分析儀測定多維氨基酸片中18種氨基酸

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50LC-MS/MS技術(shù)分析18種游離氨基酸

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53高效離子交換色譜法：主要用于蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等的分離分析，它是根據(jù)相應(yīng)的離子化程度對樣品進(jìn)行分離的，常用鹽濃度逐漸增大的方式進(jìn)行梯度洗脫的。2～10mmol/l的離子對試劑

54高效凝膠過濾色譜法根據(jù)生物藥物的分子量及其極性來對成分進(jìn)行分離測定，主要用于生化藥物的分離和分子量的測定研究。分離產(chǎn)物可以回收、可以用少量表面活性劑來改善分離效果、可根據(jù)化合物的形狀和分子量大小來預(yù)測出峰順序。具有簡便、快速、重現(xiàn)性好、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。

55HPGFC法測定重組仁腫瘤壞死因子（rh-TNF）衍生物的分子量色譜條件色譜柱：BeckmanSEC3000(300×7.5mm)流動(dòng)相:0.1mmol/lKH2PO4:0.1mmol/lNa2SO4(1:1)檢測波長：280nm柱溫：室溫流速：1.0ml/min

56Standards:醛縮酶-2、血清白蛋白-3、碳酸肝酶-4、抑蛋白酶肽-5Interstandard（IS）:右旋糖酐藍(lán)-1、酪氨酸-6

57High-performancecapillaryelectrophoresisHPCE是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)樣品中各組分之間的淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相分離技術(shù)。

58電泳?electrophoresis?是指溶液中帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的電動(dòng)現(xiàn)象。毛細(xì)管電泳?capillaryelectrophoresis?是利用被分析離子在電場作用下移動(dòng)的速率不同而達(dá)到分離的目的，這種技術(shù)主要用來分析在毛細(xì)管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì)。

59特點(diǎn)瑞典化學(xué)家Tiselius建立了“移界電泳”，成功地將人血清中的蛋白質(zhì)分為5個(gè)主要成分，為蛋白質(zhì)化學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。諾貝爾獎(jiǎng)優(yōu)點(diǎn):操作簡單，試樣量少，分離效率高，成本低等。在遷移時(shí)間上的重現(xiàn)性，進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和檢測靈敏度方面比高效液相色譜法稍遜。

60毛細(xì)管電泳的基本原理電泳分離的基礎(chǔ)?=?eE?為離子移動(dòng)的速度??e為電泳遷移率?E為毛細(xì)管柱進(jìn)樣端至檢測窗口間電場強(qiáng)度。離子的電泳遷移率不同，在電場中移動(dòng)的速度不一樣，利用這個(gè)原理可以把不同的離子彼此分離。電泳遷移率與分析物質(zhì)所帶電荷呈正比，與摩擦阻力系數(shù)呈反比。如果兩種物質(zhì)帶有不同的電荷或者通過緩沖溶液移動(dòng)的摩擦力不同，那么這兩種物質(zhì)可以彼此分離。電荷-尺寸

61電滲流在電泳過程中還存在另一種電動(dòng)現(xiàn)象，即電滲。當(dāng)高電壓通過含有緩沖溶液的毛細(xì)管柱時(shí)，管內(nèi)的溶質(zhì)向陰極或陽極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲流。在柱內(nèi)層氧化硅與溶質(zhì)的界面上形成雙電層是電滲流產(chǎn)生的原因。在典型的毛細(xì)管電泳分離中，若有電滲存在，離子的洗脫順序是:首先是最快的陽離子，緊接著是依次減慢的陽離子，然后是全部的中性分子在一個(gè)區(qū)域出現(xiàn)，最后是最慢的陰離子，緊接著的是依次加快的陰離子。

62基本構(gòu)造■■■高壓直流電源分離通道－毛細(xì)管檢測器■緩沖液貯存瓶

63毛細(xì)管電泳裝置一般在一根長40～100cm,內(nèi)徑10～100?m的毛細(xì)管柱中充入緩沖溶液，柱的兩端置于兩個(gè)緩沖池中。在兩個(gè)緩沖池之間的毛細(xì)管接有兩個(gè)鉑電極。試樣從一端進(jìn)入，而檢測器則在另一端。使用的高電壓可以反相，以能分析陰離子。

64BeckmanCECAgilentThermo

65一般的進(jìn)樣方式是電動(dòng)進(jìn)樣和壓力進(jìn)樣電動(dòng)進(jìn)樣是將毛細(xì)管柱的一端及其相應(yīng)端的電極從緩沖池中移出，放入試樣杯中，然后在一準(zhǔn)確時(shí)間范圍內(nèi)施加壓力，使試樣因離子移動(dòng)和電滲流進(jìn)入毛細(xì)管柱。壓力進(jìn)樣是用壓差使試樣溶液進(jìn)入毛細(xì)管。產(chǎn)生壓差的辦法可以采用在檢測器端抽真空，或者通過提高試樣端液面。

66DetectorUV-visECDMSLFDCLFlavonoidAlkaloidLigninCoumarinaaProteinPolypeptide

67Mainseparationmode■■■■■CapillaryZoneElectrophoresisCZEMicellarElectrokindticCapillaryChromatographyMECCCapillaryIsotachphoresisCITPCapillaryGelElectrophoresisCGECapillaryelectro-chromatographyCEC

68毛細(xì)管區(qū)帶電泳交束毛細(xì)管動(dòng)電色譜毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管電色譜

69Sophorasubprostata

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71Tamsulosin坦索洛新

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75Individualplasmaconcentration–timecurvesofanisodamineenantiomersafterani.g.administrationof140mg/kginfiverabbits.(1)(6R,2S)-,(2)(6S,2R)-,(3)(6R,2R)-,(4)(6S,2S)-anisodamine.

76Individualplasmaconcentration–timecurvesofanisodamineenantiomersafterani.v.administrationof50mg/kginfiverabbits.(1)(6R,2S)-,(2)(6S,2R)-,(3)(6R,2R)-,(4)(6S,2S)-anisodamine.

77Editor-in-ChiefZiadElRassi(Stillwater,OK,USAhttp://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jabout/10008330/2027_edbd.htmlIF=4.101

78【練習(xí)與思考】1、名詞解釋：生化藥物、生物制品、聯(lián)合疫苗2、簡述生物制品的種類及特點(diǎn)？3、簡述生物制品的安全性檢查內(nèi)容及要求？4、簡述生物制品含量測定中的高效液相色譜法的分類及特點(diǎn)？