DB22T 2600-2016 梅花鹿、馬鹿茸片鑒別方法PCR法

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1、ICS67.120B45備案號(hào)：54271-2017DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2600—2016梅花鹿、馬鹿茸片鑒別方法PCR法IdentificationofSikaDeerandWapitiVelvetSlices——PolymeraseChainReactionMethod2016-12-22發(fā)布2017-04-01實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2600—2016前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊穎、邢秀梅、

2、榮敏、劉敏、武薇、吳瓊、徐超、徐佳萍、涂劍鋒、劉匯濤、劉華淼。IDB22/T2600—2016梅花鹿、馬鹿茸片鑒定方法PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了梅花鹿、馬鹿茸片的PCR鑒定方法的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、試驗(yàn)步驟、結(jié)果判定、廢棄物處理和防止污染的措施。本標(biāo)準(zhǔn)適用于梅花鹿、馬鹿茸片產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語和定義下列術(shù)語

3、和定義適用于本文件3.1鹿茸片deervelvetslices為梅花鹿和馬鹿的商品茸利用特制的切具切制的薄片。4原理利用梅花鹿、馬鹿線粒體DNA（mtDNA）的D-loop區(qū)特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增特異性DNA片段，依據(jù)是否擴(kuò)增出特異性片段對(duì)鹿茸片進(jìn)行鑒定。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.1水，GB/T6882，一級(jí)。5.2十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）。5.3三羥甲基氨基甲烷（Tris）。5.4乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)。5.5十二烷基硫酸鈉（SDS）。5.6氯化鈉。5.7三氯甲烷。5.8異丙醇。5.9無水乙醇。1DB22/T

4、2600—20165.1070%乙醇。5.11CTAB提取緩沖液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa2EDTA,pH8.0。5.12CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。5.13蛋白酶K溶液（20mg/mL）。5.14NaCl溶液（1.2mol/L）。5.15TE緩沖液（Tris-Cl、EDTA緩沖液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）,1mmol/LEDTA（pH8.0）。5.16引物，，DF5-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3，，DR5-CATGGTAATT

5、AAGCTCGTGATCTA-36儀器設(shè)備6.1PCR儀。6.2紫外分光光度計(jì)或核酸蛋白分析儀。6.3電泳儀。6.4凝膠成像系統(tǒng)。6.5電子天平：感量0.0001g。6.6離心機(jī)：離心力≥12000rpm。6.7渦旋振蕩器。6.8恒溫水浴鍋。6.9研缽或粉碎裝置。6.10微量移液器：0.5μl～10μl，10μl～100μl，20μl～200μl，200μl～1000μl。7試驗(yàn)步驟7.1樣品制備將樣品用研缽或粉碎裝置研磨成粉末狀即可。7.2DNA提取7.2.1將樣品研磨后，稱取200mg左右樣品于2mL離心管中，加入1.5mLCTAB提取緩沖液和40μL蛋白酶K溶液。7.2.260

6、℃震蕩過夜后13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中。7.2.3加入750μL三氯甲烷后用力震蕩，13000g離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。7.2.4加入2倍體積的CTAB沉淀溶液，室溫靜置60min，13000g離心15min，棄去上清液。7.2.5加入350μLNaCL溶液將沉淀進(jìn)行懸浮。再加入350μL三氯甲烷，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000g離心10min。7.2.6轉(zhuǎn)移上清液后加入0.6倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清液。7.2.7加入500μL75%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于200μL超純水中。立即使

7、用或-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.8也可用等效的DNA提取方法提取模板DNA。7.3DNA質(zhì)量的測(cè)定2DB22/T2600—2016使用紫外分光光度計(jì)或核酸蛋白分析儀，分別測(cè)定260nm和280nm處吸光值（OD）為A260和A280，DNA濃度按公式（1）計(jì)算。當(dāng)A260/A280比值在1.6～1.8之間，適宜PCR擴(kuò)增。A?N?50C?.....................................(1)1000式中：C——DNA濃度，為微克每微