DB41∕T 2371-2022 豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范(河南省).pdf

《DB41∕T 2371-2022 豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范(河南省).pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

ICS65.020.30CCSB4341河南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB41/T2371—2022豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范2022-12-22發(fā)布2023-03-21實(shí)施河南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布 DB41/T2371—2022目次前言.................................................................................II1范圍...............................................................................12規(guī)范性引用文件.....................................................................13術(shù)語和定義.........................................................................14基本要求...........................................................................25稀釋液配制.........................................................................26品質(zhì)檢查...........................................................................27精液冷凍...........................................................................28解凍檢測(cè)與儲(chǔ)存.....................................................................39冷凍質(zhì)量要求.......................................................................310生產(chǎn)記錄..........................................................................411運(yùn)輸..............................................................................4附錄A（資料性）豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備表.............................................5附錄B（資料性）凍精生產(chǎn)相關(guān)稀釋液配制...............................................6附錄C（資料性）精液離心和稀釋.......................................................7附錄D（資料性）豬冷凍精液生產(chǎn)記錄樣式...............................................8I DB41/T2371—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由河南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、河南省畜牧技術(shù)推廣總站、河南精旺豬種改良有限公司、牧原食品股份有限公司、漯河市畜牧工作站、北京田園奧瑞生物科技有限公司。本文件主要起草人：邢寶松、張家慶、王獻(xiàn)偉、盧清俠、原黎偉、葛位西、胡波、徐澤君、李彥朋、呂玲燕、蔣凡、申明、和小娥、高彬文、蔣立云、任巧玲、陳俊峰、王璟、馬強(qiáng)、牛剛。II DB41/T2371—2022豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了豬冷凍精液生產(chǎn)與保存的基本要求和技術(shù)要求。包括精液采集、稀釋液配制、品質(zhì)檢查、精液冷凍、解凍品質(zhì)檢測(cè)、凍精包裝、儲(chǔ)存及運(yùn)輸?shù)葍?nèi)容。本文件適用于豬冷凍精液生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4143—2008牛冷凍精液GB/T5458—2012液氮生物容器GB/T23238—2021種豬常溫精液GB/T25172—2020豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范GB/T30396—2013牛冷凍精液包裝、標(biāo)簽、貯存和運(yùn)輸NY/T1234—2018牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T2077—2011種公豬站建設(shè)技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1種公豬體型外貌和性能質(zhì)量符合種用標(biāo)準(zhǔn)要求的公豬。3.2凍精細(xì)管用于分裝精液的耐凍、無毒的聚氯乙烯復(fù)合塑料細(xì)管。3.3冷凍精液經(jīng)特殊方法處理經(jīng)超低溫冷凍并可在液氮中（-196℃）長期保存的精液。簡稱凍精。3.4細(xì)管冷凍精液冷凍細(xì)管裝入精液經(jīng)液氮冷凍所形成的產(chǎn)品。3.5細(xì)菌數(shù)每劑量精液經(jīng)培養(yǎng)后觀察到的細(xì)菌菌落數(shù)。1 DB41/T2371—20223.6活力在37℃下呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子占總精子數(shù)的百分率。3.7畸形率畸形精子占總精子數(shù)的百分比。4基本要求4.1種公豬應(yīng)符合NY/T2077—2011中8.2.1的要求，其他應(yīng)符合GB/T25172—2020中4.1的要求。4.2原精液應(yīng)符合GB/T25172—2020中5.2.2的要求。4.3操作環(huán)境應(yīng)符合NY/T2077—2011中7.3的要求。4.4采集量地方品種≥50mL,其他≥100mL。4.5環(huán)境精液采集室、精液檢測(cè)室的環(huán)境條件應(yīng)符合NY/T2077—2011中7.4～7.5的要求。4.6儀器設(shè)備4.6.1儀器設(shè)備的配置應(yīng)滿足豬冷凍精液生產(chǎn)的要求(生產(chǎn)儀器設(shè)備見附錄A)。4.6.2儀器設(shè)備運(yùn)行正常，定期進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)。4.6.3計(jì)量儀器（電子天平、恒溫箱等）、超純水儀、恒溫?zé)崤_(tái)、高壓鍋等應(yīng)定期校準(zhǔn)或維護(hù)保養(yǎng)。4.6.4用品、器具等應(yīng)按要求進(jìn)行清洗和消毒。清洗和消毒應(yīng)符合NY/T1234—2018附錄A中的規(guī)定。5稀釋液配制5.1配制稀釋液用水應(yīng)為新鮮無菌的蒸餾水、重蒸水或超純水。稀釋液所用化學(xué)試劑應(yīng)為分析純以上級(jí)別，所用卵黃應(yīng)來源于無特定病原體雞場(chǎng)的新鮮雞蛋，配制方法見附錄B。稀釋液配制需現(xiàn)用現(xiàn)配，化學(xué)試劑需精確稱量，配制稀釋液滅菌容器需要進(jìn)行標(biāo)記，配制完成后需在瓶上標(biāo)記日期、名稱、保存時(shí)間等。5.2使用商品稀釋液應(yīng)嚴(yán)格按照使用說明書的要求操作。6品質(zhì)檢查精液品質(zhì)檢查應(yīng)按照GB/T23238—2021附錄A中的規(guī)定執(zhí)行。7精液冷凍2 DB41/T2371—20227.1預(yù)稀釋及平衡經(jīng)過質(zhì)量評(píng)估合格的精液，用等溫預(yù)熱且與精液溫度一致的預(yù)稀釋液（配制見附錄B）按照1:1～1:1.2比例稀釋，稀釋后的精液于室溫（25℃）靜置1h，轉(zhuǎn)入17℃恒溫冰箱，平衡2h～3h。7.2離心稱量離心瓶重w（0g），將離心瓶預(yù)冷至17℃，然后將17℃平衡好的精液裝入離心瓶進(jìn)行離心（17℃條件下，800g離心10min），棄上清液，稱重w1（g）。7.34℃平衡用17℃預(yù)冷的冷藏保護(hù)液（Ⅰ液）（配制見附錄B）重懸精子,重懸后置于盛有17℃水的500mL燒杯中，于4℃冰箱或低溫操作柜中緩慢降溫至4℃～5℃（2.5h～3h）。按1:1加入冷凍保護(hù)液（Ⅱ液）（配制見附錄B）混勻，在4℃下繼續(xù)平衡0.5h～1h,然后在低溫操作柜中進(jìn)行灌裝。7.4冷凍7.4.1程序冷凍在灌裝的同時(shí)開啟程序冷凍儀，選定冷凍曲線，待冷凍儀溫度穩(wěn)定在初始溫度（4℃～5℃）后，迅速將擺放好細(xì)管的托架放入冷凍室中，啟動(dòng)冷凍程序。待冷凍曲線走完后，將托架迅速取出放入裝有液氮的泡沫箱中，液氮深度至少浸沒所有細(xì)管。7.4.2熏蒸冷凍將液氮倒入深度50cm以上的專用冷凍箱預(yù)冷10min,保持冷凍支架上的細(xì)管在液氮面之上2cm,熏蒸冷凍8min,最后將冷凍樣品浸入液氮中。7.4.3分裝將細(xì)管支架升到液氮面上1cm～2cm，然后將細(xì)管凍精裝入拇指管（每管12支），再將拇指管裝入紗布袋（每袋6管），在紗布袋或拇指管上標(biāo)記或貼上打印好的標(biāo)簽。8解凍檢測(cè)與儲(chǔ)存8.1凍后抽檢每份原精液制作的細(xì)管凍精至少抽取3支進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)管從液氮罐中取出后在空氣中停留2s～3s，迅速置于50℃水浴中解凍16s，擦干表面水分后，將精液移入5mL離心管中，用預(yù)熱到37℃的解凍稀釋液（配制見附錄B）作10倍稀釋。在37℃水浴中維持10min～15min，然后在顯微鏡下檢測(cè)解凍后精子活力，如活力合格，即可將凍精轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。8.2包裝外包裝上標(biāo)明生產(chǎn)場(chǎng)、品種、種公豬號(hào)、生產(chǎn)日期和支數(shù)等。8.3儲(chǔ)存儲(chǔ)存方法應(yīng)符合GB/T30396—2013中的要求，容器質(zhì)量應(yīng)符合GB/T5458—2012中的規(guī)定。9冷凍質(zhì)量要求3 DB41/T2371—20229.1精子活力≥40%。9.2精子畸形率≤20%。9.3細(xì)菌數(shù)≤1600個(gè)/mL，按GB/T4143—2008附錄B中規(guī)定的方法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)測(cè)定。10生產(chǎn)記錄做好豬凍精生產(chǎn)相應(yīng)記錄，參見附錄D。11運(yùn)輸應(yīng)符合GB/T30396—2013中8.1～8.3的要求。4 DB41/T2371—2022AA附錄A（資料性）豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備表豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備見表A.1。表A.1豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備表名稱規(guī)格及用途采精架（假臺(tái)豬）采精用，可升降、調(diào)角度防滑墊環(huán)保橡膠，不含滑石粉添加劑，（采精室地面防滑）恒溫水浴鍋數(shù)顯式控溫，控溫精度±1℃電熱恒溫培養(yǎng)箱數(shù)顯溫度、可控溫度34℃±1℃磁力攪拌器可恒溫、調(diào)速電子精密臺(tái)稱精液、稀釋粉稱重電子天平0～300g±0.01g，化學(xué)試劑稱量pH計(jì)0.0～14.0±0.1，測(cè)定精液、稀釋液的pH值血球計(jì)數(shù)板測(cè)定精液中精子數(shù)量超純水儀稀釋液用水離心機(jī)單孔200mL～750mL液氮容器（不同型號(hào)）貯存液氮，精液冷凍和保存微量移液器50uL～100uL微量移液器100uL～1000uL溫度計(jì)溫度測(cè)量，0℃～60℃磁力攪拌器可恒溫、調(diào)速采精保溫杯600mL量筒500mL、1000mL，量取液體三角燒杯50mL、100mL、250mL、500mL精子密度測(cè)定儀精液中精子密度的測(cè)定,億/mL精子質(zhì)量分析系統(tǒng)40X～600X；有相差鏡頭，觀測(cè)精子數(shù)、活力和畸形率顯微鏡恒溫臺(tái)（板）數(shù)顯溫度，加熱恒溫提高精子活體觀察的準(zhǔn)確性細(xì)管精液分裝機(jī)封裝細(xì)管精液低溫平衡柜稀釋后的精液平衡，細(xì)管精液封裝精液冷凍程控儀細(xì)管精液冷凍，控溫范圍30℃～180℃5 DB41/T2371—2022BB附錄B（資料性）凍精生產(chǎn)相關(guān)稀釋液配制B.1預(yù)稀釋液主要成分：Tris、檸檬酸、葡萄糖、半胱氨酸。取2L量杯和2L加厚采精袋各1個(gè)，將采精袋套在燒杯內(nèi)部，取一袋豬凍精試劑A（預(yù)稀釋劑），全部加入采精袋內(nèi)，然后將燒杯放到天平上，歸零，加入1000g水，用橡皮筋扎緊袋口，混勻，置水浴鍋預(yù)熱至35.5℃左右備用。B.2基礎(chǔ)營養(yǎng)液主要成分：葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、HEPES鈉、Tris、EDTA?2Na、碳酸氫鈉、半胱氨酸。取2L量杯和1L加厚采精袋各3個(gè)，每個(gè)量杯套一個(gè)采精袋。往其中一個(gè)采精袋中加入1000g水，再加入整瓶豬凍精試劑B（基礎(chǔ)營養(yǎng)劑），混勻，為基礎(chǔ)液。B.3Ⅰ液（冷藏保護(hù)液）將250mL蛋黃加入到1L基礎(chǔ)營養(yǎng)液中，為冷藏液，使用前置于恒溫箱內(nèi)17℃保存。B.4Ⅱ液（冷凍保護(hù)液）主要成分:葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、HEPES鈉、Tris、EDTA?2Na、碳酸氫鈉、半胱氨酸、甘油、SDS。取I液276mL置于500mL的燒杯中，用注射器抽取18mL豬冷凍試劑C和移液器吸取6mL豬冷凍試劑D(冷凍保護(hù)劑)加至其中，混勻，為冷凍液，置4℃?zhèn)溆?。B.5解凍液主要成分：葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、HEPES鈉、Tris、EDTA?2Na、碳酸氫鈉、半胱氨酸、茶堿。稱取適量（2mL/0.5mL冷凍細(xì)管）豬凍精試劑E（解凍劑）置于玻璃試管中，然后加入蒸餾水以1:20比例混勻，置30℃?zhèn)溆谩? DB41/T2371—2022CC附錄C（資料性）精液離心和稀釋C.1精液離心C.1.1離心前應(yīng)準(zhǔn)確稱量離心管凈重（g）,做好標(biāo)記。C.1.2降、恒溫后精液在17℃環(huán)境條件下800g離心10min,棄上清，稱重。精子體積按式（C.1）計(jì)算：(v0=(????1?????0)1.04)·····························································(C.1)式中：v0——濃縮后精子體積，單位為mL；????1——離心瓶加精子重，單位為g；????0——離心瓶重，單位為g；1.04——濃縮后精液比重估計(jì)值。C.2稀釋C.2.1濃縮后精液稀釋總倍數(shù)：N=P0?每劑有效體積/每劑總精子數(shù)量-1（有效體積按0.45mL計(jì)）C.2.2第一稀釋倍數(shù)N1=（N+1）/2-1（稀釋后體積為凍前體積的一半）C.2.3Ⅰ液用量（mL）V1=N1?V0C.2.4Ⅱ液用量（mL）V2=（N1+1）?V0C.2.5最終可分裝細(xì)管數(shù)=（N+1）?V0/0.57 DB41/T2371—2022DD附錄D（資料性）豬冷凍精液生產(chǎn)記錄樣式豬冷凍精液生產(chǎn)相應(yīng)記錄樣式見表D.1。表D.1豬冷凍精液生產(chǎn)記錄樣式日期公豬號(hào)采精量采集員顏色活力密度檢查員預(yù)計(jì)生冷凍后冷凍數(shù)操作員備注mL億/mL產(chǎn)支數(shù)活力量8