5雜氮2脫氧胞苷對(duì)bgc823胃癌細(xì)胞株riz1基因去甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

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1、5雜氮2脫氧胞苷對(duì)BGC823胃癌細(xì)胞株RIZ1基因去甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用【摘要】目的:探討5雜氮2脫氧胞苷（5AzaCdR）對(duì)人胃癌細(xì)胞系BGC823細(xì)胞株RIZ1基因的去甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及對(duì)細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖的影響，尋找胃癌治療的新靶點(diǎn).方法:使用3種不同濃度5AzaCdR干預(yù)胃癌BGC823細(xì)胞，甲基化特異性PCR（MSP）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測(cè)藥物干預(yù)前后RIZ1基因的甲基化狀態(tài)和RIZ1mRNA的表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的改變.結(jié)果:未經(jīng)5

2、AzaCdR處理的BGC823細(xì)胞中RIZ1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島高甲基化，且RIZ1mRNA不表達(dá)，經(jīng)2，5，10μmol/L5AzaCdR處理48h后，RIZ1基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化得到逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞中均有RIZ1mRNA表達(dá)，相對(duì)定量值分別為0.509，0.716，0.831；3種濃度5AzaCdR處理BGC823細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖速度出現(xiàn)不同程度減慢（P＜0.05），隨著濃度的增加其抑制作用增強(qiáng)；并顯著抑制BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)周期,與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加，S期細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡

3、率明顯升高（P＜0.05）.結(jié)論:5AzaCdR能有效逆轉(zhuǎn)胃癌BGC823細(xì)胞RIZ1基因的異常甲基化，從而激活因高甲基化導(dǎo)致RIZ1基因沉默的再轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng).【關(guān)鍵詞】胃腫瘤腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的5雜氮2′脫氧胞苷RIZ1基因DNA甲基化　　0引言　　抑癌基因失活是胃癌發(fā)生的重要原因，多種抑癌基因由于啟動(dòng)子區(qū)域CpG島高甲基化而導(dǎo)致其失活已得到廣泛證實(shí).DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5雜氮2脫氧胞苷（5AzaCdR）通過(guò)抑制甲基化酶，可使多種啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化的抑癌基因重新表達(dá)或表

4、達(dá)增高［1］.RIZ基因（Rbinteractingzincfingergene）是Buyse等［2］對(duì)可與Rb結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性篩選時(shí)分離出的，定位于人染色體1p36.能夠產(chǎn)生兩種交替出現(xiàn)的蛋白產(chǎn)物RIZ1和RIZ2.RIZ1基因是一種新型腫瘤抑制基因，在胃癌中對(duì)該基因的研究，國(guó)內(nèi)少見(jiàn)報(bào)道.為研究胃癌中該基因的甲基化狀態(tài)及CpG島去甲基化后其轉(zhuǎn)錄活性的表達(dá)，我們應(yīng)用5AzaCdR對(duì)BGC823細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察RIZ1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況及細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，從而為胃癌的臨床治療提供分子水平依據(jù).　　1材料和方

5、法　　1.1材料人胃癌細(xì)胞株BGC823由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；RPMI1640（Gibco公司）；5AzaCdR（Sigma公司），用PBS充分溶解后配制成1mol/L的母液，-20℃保存.EZDNAMethylationGoldKit(北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司),AMV第1鏈cDNA試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；引物合成（大連寶生物工程有限公司），MTT及PI（Sigma公司）.　　1.2方法　　1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

6、和干預(yù)將BGC823細(xì)胞用含100mL/L小牛血清、100ku/L青霉素和100ku/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在50mL/LCO2濃度，37℃、濕度飽和的條件下培養(yǎng).另配制含2,5,10μmol/L5AzaCdR的完全培養(yǎng)液.取傳代后24h的細(xì)胞，分別加入含3種不同5AzaCdR濃度的完全培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，培養(yǎng)48,72h后回收細(xì)胞.對(duì)照組使用不含5AzaCdR的普通完全培養(yǎng)液.　　1.2.2MSP法檢測(cè)5AzaCdR干預(yù)前后BGC823細(xì)胞中RIZ1基因甲基化狀態(tài)取對(duì)照組和藥物干預(yù)48

7、h后BGC823細(xì)胞，應(yīng)用飽和酚氯仿法抽提細(xì)胞基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度及含量.取20μgDNA，參照EZDNAMethylationGoldKit說(shuō)明書(shū)對(duì)基因組DNA行亞硫酸氫鹽修飾.以亞硫酸氫鹽修飾后DNA為模板，使用甲基化擴(kuò)增試劑盒分別用甲基化引物和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有PCR擴(kuò)增均使用25μL反應(yīng)體系.引物參考文獻(xiàn)［3］，甲基化引物：上游5′GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3′，下游：5′GCTATTTCGCCGACCCCGACG3′，擴(kuò)增片段為177bp，PC

8、R反應(yīng)條件：95℃變性10min，94℃變性30s，68℃退火45s，72℃延伸60s，共40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸6min；非甲基化引物：上游5′TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3′，下游5′ACTATTTCACCAACCCCAAGA3′，擴(kuò)增片段為175bp,PCR反應(yīng)條件：95℃變性10min，94℃變性30