牦牛胃蛋白酶原c基因的克隆及序列分析

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1、—36—江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年第42卷第5期朱小翌，張林，駱美蓉，等．牦牛胃蛋白酶原C基因的克隆及序列分析［J］．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(5):36－38．牦牛胃蛋白酶原C基因的克隆及序列分析1，21，22，31，21，21，21，2朱小翌，張林，駱美蓉，江偉華，林忠荔，劉益麗，江明鋒(1．動(dòng)物遺傳育種學(xué)國(guó)家民委－教育部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室四川成都610041;2．西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041;3．青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041))摘要:采用ＲT－PCＲ技

2、術(shù)，成功獲得了牦牛胃蛋白酶原C基因，用ProtParam在線工具對(duì)牦牛胃PGC蛋白的基本性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，其相對(duì)分子質(zhì)量為42931．6，pI值為4．45，半衰期為30h，不穩(wěn)定系數(shù)為40．76，總平均親水性為0．041。對(duì)該蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，牦牛胃蛋白酶結(jié)構(gòu)與黃牛沒(méi)有明顯區(qū)別，均含有5個(gè)α－螺旋、25個(gè)β－折疊，三維結(jié)構(gòu)也基本一致。關(guān)鍵詞:牦牛;PGC基因;克隆;序列分析+中圖分類號(hào):TS201．25;Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1002－1302(2014)05－0036－03酸性蛋白酶

3、是胃蛋白酶、凝乳酶、微生物蛋白酶等的統(tǒng)族羌族自治州紅原縣;exTaq酶、pGEM－TEasy載體試劑盒、稱。目前，酸性蛋白酶被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料添加劑、T4連接酶均購(gòu)于天根生化科技有限公司;cDNA合成試劑盒［1－5］釀造、皮革制造、醫(yī)藥等行業(yè)。國(guó)際上研究最多的是胃蛋為Thermo產(chǎn)品。白酶。龐美蓉等研究發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶能有效斷裂大豆蛋白質(zhì)中1．1．2引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank收錄的黃牛的肽鍵，提高溶解度并且消化抗?fàn)I養(yǎng)因子，提升了大豆的營(yíng)養(yǎng)PGC、GAPDH基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，序列為PGC－F:5'

4、－［6］ATGAAGTGGATGGTACTGGCCTT－3';PGC－Ｒ:5'－AATA-價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)胃蛋白酶的研究主要集中在采用亞硝基胍、紫外線、輻射等方法進(jìn)行微生物源產(chǎn)酶菌株的選育。通過(guò)AACAGCTCTTCTCCACGTTGG－3';PGC－qPCＲ－F:大腸桿菌、酵母及曲霉表達(dá)的重組凝乳酶已經(jīng)上市，并取得了5'－TGAGGACCTACAAGCACGA－3';PGC－qPCＲ－Ｒ:5'－［7］ATAGCCTAAGATGCCAGTGAG－3';YAK－GAPDH－F:5'－較好的經(jīng)濟(jì)效益。目前，學(xué)者們主

5、要從豬、牛、羊等動(dòng)物黏膜中提取胃蛋白酶遺傳資源。本研究分析了克隆得到的麥洼牦GACAAGATGGTGAAGGTCGGA－3';YAK－GAPDH－Ｒ:5'－牛胃蛋白酶原C基因(PGC)的結(jié)構(gòu)，旨在為研究青藏高原特有TTACTCCTTGGAGGCCATGTG－3'。引物由上海生工生物工動(dòng)物牦牛的基因資源并拓寬工程胃蛋白酶來(lái)源提供依據(jù)。程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1．2方法1材料與方法1．2．1牦牛復(fù)胃組織總ＲNA的提取按照試劑盒說(shuō)明書用1．1材料TＲIzol法提取牦牛復(fù)胃總ＲNA，測(cè)量其D260nm/D280nm值，1

6、．1．1材料與試劑牦牛復(fù)胃組織樣品采自四川省阿壩藏－80℃密封保存?zhèn)溆谩?．2．2cDNA的合成、擴(kuò)增和回收目的基因以牦牛復(fù)胃總收稿日期:2013－11－08ＲNA為模板，使用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成牦牛復(fù)胃基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):31172198);教育部科學(xué)技術(shù)研cDNA。以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，PGC－F、PGC－Ｒ為引究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào):2102654);西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)物，擴(kuò)增PGC基因。PCＲ反應(yīng)條件為:95℃1min;95℃務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(編號(hào):2014NZYQN59);留

7、學(xué)歸國(guó)人員項(xiàng)目;西南民族大30s，60℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán);72℃5min。PCＲ反學(xué)2013年研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目(編號(hào):CX2013SZ64)。應(yīng)體系:cDNA模板1．5μL，PrimerF(10μmol/L)1μL，Primer作者簡(jiǎn)介:朱小翌(1989—)，男，湖北洪湖人，碩士研究生，從事遺傳Ｒ(10μmol/L)1μL，EXTaqDNA聚合酶0．2μL，dNTP混合學(xué)研究。E－mail:604417607@qq．com。物1μL，Mg2+2μL，加ddHO至20μL體系。PCＲ產(chǎn)物經(jīng)2通信

8、作者:江明鋒，博士，教授，從事遺傳學(xué)研究。E－mail:1%Agarose電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒回收PCＲmingfengjiang@vip．sina．com。片段，并用0．7%Agarose電泳檢測(cè)膠回收片段。櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［4］王振金，王建民，王桂芝，等．嶗山奶山羊骨橋蛋白基因(