豬胸膜肺炎放線桿菌毒素ⅢA基因的克隆、序列分析及原核.pdf

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1、!"卷"期微生物學(xué)報(bào)&’()!".’)"#$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,-#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!豬胸膜肺炎放線桿菌毒素!!基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)陳漢陽劉軍發(fā)何啟蓋肖少波陳煥春"（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物病毒室武漢!"$$9$）摘要：因胸膜肺炎放線桿菌的致病性主要是由毒素決定的，故參照豬胸膜肺炎放線桿血清#型菌株的序列（J-,15,KL/#/!M）設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，用NOP的方法擴(kuò)增!"#!$基

2、因并得到了長"!%%CB的片段，然后將其克隆到BQR8/72中，經(jīng)酶切鑒定和序列分析表明克隆是成功的；再將!"#!$插入到原核表達(dá)載體B:28#7C后，轉(zhuǎn)化1L#/（R:"），在SN2J誘導(dǎo)下獲得高效表達(dá)，經(jīng)T-U@-V,C(’@@<,I檢測(cè)證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物有活性。以表達(dá)產(chǎn)物包被:LSW0板，建立了特異、敏感的:LSW0診斷方法。關(guān)鍵詞：胸膜肺炎放線桿菌，毒素!0（5B6!0），克隆，原核表達(dá)中圖分類號(hào)：X97%文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：0文章編號(hào)：/$$%8%/9F（#$$"）$"8$"#!8$%豬傳染性胸膜肺炎是危害當(dāng)前世界各國養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之

3、一，這種病是由胸膜肺炎放線桿菌（$%&’()*!%’++,-"+.,/)"(.,0)(’.，0BB）引起的。目前0BB共發(fā)現(xiàn)有/M種血清［/］型，并且各個(gè)國家流行的優(yōu)勢(shì)血清型各不相同。不同血清型之間及同一血清型的不同菌株的毒力均存在差異，致病性也有強(qiáng)弱之分，從而導(dǎo)致該病的診斷和治療非常困難。近幾年來的研究表明，與病原菌毒力相關(guān)的因子有毒素、莢膜、外膜蛋白、脲酶等，其中毒素既是主要的毒力因子，也是主要的免疫原，可作為診斷抗原建立血清學(xué)檢測(cè)方法，還可以用于診斷和衡量免疫狀態(tài)，因此毒素研究已成為該病研究熱點(diǎn)。胸膜肺炎放線桿菌共有!種毒素，

4、即毒素"，#，!以及最近發(fā)現(xiàn)的毒素$，它們均屬于P2Y毒素家族。毒素"具有很強(qiáng)的溶血活性，毒素#相對(duì)較弱，毒素!雖沒有溶血活性，但細(xì)胞毒性較強(qiáng)。分泌表達(dá)上述毒素均需相鄰的1、O、0、R四種基因的共同作用，其中0基因編碼毒素的結(jié)構(gòu)蛋白。因此對(duì)毒素!0基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，將有助于闡明0BB的分子致病機(jī)理，在研制新型疫苗和建立診斷方法等方面具有潛在的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。這方面的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以胸膜肺炎放線桿菌血清#型標(biāo)準(zhǔn)菌株為材料，克隆鑒定了編碼毒素!結(jié)構(gòu)蛋白的0基因，進(jìn)行序列分析后實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)T-U@-

5、V,C(’@@<,I和:LSW0證實(shí)有生物活性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下?；痦?xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（"$#$$$//）；湖北省“十五”重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（#$$/00#$/1$#）"通訊作者。2-(3456：7%8#9879#7#%$7；:8;5<(：=>5+?-@AB+C(

6、菌毒素#!基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)K#:!材料和方法!"!材料!"!"!菌株、質(zhì)粒和載體：!""血清#型，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所逯忠新研究員惠贈(zèng)；"$%&’()（)&*+,-./）購自大連寶生物公司；"012+3,/4"-!56（7）、!8"#$%%9:"、0;#’、"<)&#(=，本室保存。!"!"#工具酶及主要試劑：限制性內(nèi)切酶、<>)?@%A!聚合酶、)B%A!連接酶（)?6?C?），%A!凝膠回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司），豬抗!""血清#型抗血清（本室自制），9CD標(biāo)記鼠抗豬EFG抗體（華美生物公司）

7、，其它試劑均為分析純。!"!"$培養(yǎng)基：;0培養(yǎng)基、DD;H培養(yǎng)基，均按常規(guī)方法配制。!"!"%引物：根據(jù)G?I0?IJ上!""血清#型的序列（;’#’B:）設(shè)計(jì)合成（上海生工生物工程有限公司）了一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增片段大小為KBLL="。上游引物序列為：:MG)!N))GG)N!!GN!)G))!GNNGKM；下游引物序列為：:M)!!NG)G))G!NN!)N!)N)NGNNKM。!"#方法!"#"!!""基因組的提取及DNC模板的制備：具體操作參照文獻(xiàn)［#］進(jìn)行。!"#"#DNC反應(yīng)條件：OBP預(yù)熱BQ4I，OBP變性LR3，

8、LSP復(fù)性S:3，S#P延伸’L:3，KR個(gè)循環(huán)，最后再S#P延伸’#Q4I。!"#"$DNC產(chǎn)物的鑒定及克?。篋NC擴(kuò)增得到的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在紫外燈下觀察回收后，與)&*+,-./連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌%9:"，經(jīng)藍(lán)白斑篩選