中國野牦牛blg基因的克隆及序列分析

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1、題目：.中.國野墓因的.京鷹及序列分折學院：化學工程妄技術學院專此：±T.13_02_5JI姓名：學號：指導老I師：劉建忠成績：二o—六年六月—H四日摘要眾所周知，遺傳多樣性(Geneticdiversity)是生物多樣性(Biodiversity)的重耍組成部分，而牦牛又是高原地區(qū)不可缺少的物種之一。牦牛為當?shù)氐霓r牧民提供包括皮毛，牛奶以及畜力等多種資源。近年來，隨著機械化在廣大牧區(qū)的推廣,作為重要勞力的牦牛數(shù)量銳減，隨之而來的是遺傳資源的喪失?！跚埃澜鐡碛屑s1400萬頭家牦牛和15000頭野牦牛，其屮屮國擁有世界上最多的牦牛數(shù)量和品種(群體)[1’2]。自20世紀

2、70年代以來，牦牛群體遺傳學(Populationgenetics)就廣泛受到學者們的夫注，對于犧牛的認知，人們在形態(tài)學水平，細胞(染色體)水平，生理生化水平以及DNA序列的遺傳變異方而都已經冇了大致的了解。冇序生物學技術的迅猛發(fā)展，近幾年專家已將視野轉移到牦牛的分子水平的遺傳多樣性研究。并且，開展有關牦牛遺傳多樣性的研究不僅可以有效的分析牦牛種群的遺傳變異，也為后續(xù)其他物種的保護及繁育奠定基礎。木研究中的野牦牛肌肉組織樣品采G在四川省甘孜藏族CJ治區(qū)甘孜縣東郊一屑宰場，并成功地從肌陶組織中提取到基因組DNA。根據(jù)相關文獻設計了一對PCR(PolymeraseChainR

3、eaction)引物，以擴增野牦牛的乳球蛋白基因5’調控區(qū)的核苷酸序列。核苷酸序列比對結果表明，野牦牛的乳球蛋白基因(lactoglobulingene,BLG)啟動區(qū)序列與報道的家特牛的序列的同源性為99.17%；與水牛BLG基因的核苷酸序列同源性為99.52%。本研究成功地采用PCR擴增的方法克隆的來自我國野牦牛乳球蛋白基因5’調控區(qū)基因片段，測定丫核苷酸組成，并比對了核苷酸序列的同源性，為開展以核苷酸序列為依據(jù)的動物遺傳多樣性評估提供了重要的依據(jù)。關鍵詞：野牦牛;乳球蛋白基5’調控區(qū);遺傳多樣性1前言遺傳多樣性是衡量一個種、亞種或種群內基因變異的依據(jù)。我們在研究一個

4、種群的遺傳學問題時，必須?？紤]遺傳多樣性的存在。而如今生態(tài)環(huán)境每況愈下，有關物種的遺傳多樣性的研究迫在眉睫。如來宥朝一口遺傳多樣性面臨喪失的險境，那么也就意味著我們人類賴以生存資源即將永久性的喪失。所以從廣義上講,保護遺傳多樣性就是保持生物多樣性和人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境［3］。遺傳多樣性可用來描述種群的遺傳變異和研究維持變異的機制［4］。通過對一個物種遺傳多樣性的研究，就可以直接反映出該物種種群的多樣性，因為物種多樣性來G于進化過程中的遺傳多樣性［5］。再者，面對現(xiàn)如今糟糕的生態(tài)環(huán)境，我們在研究物種遺傳多樣性的向時，更多的是對生物物種的保護。我們需要對那些已經瀕臨滅絕的的

5、物種進行詳細的遺傳多樣性檢測，通過遺傳標記等方法所敁示的結果，我們可以大致分析該物種的遺傳變異，進而采取有效的保護措施。此次研究所選擇的動物品種牦牛(Bosgrunniens),是分介'在海?拔3000m以上，主要生存在中國青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的牛種之一［6］。大量的考古學的證據(jù)表明，牦牛起源于我國的青藏高原，□前，我國牦牛的種群數(shù)量大約為1200萬頭，約占世界牦牛總數(shù)的95%,另外W個牦牛的主要分布地區(qū)包括尼泊爾和印度。在遺傳上是一個極為寶貴的基因庫［7］。近年來，隨著機械化作業(yè)在廣大牧區(qū)的推廣，作為傳統(tǒng)備力的牦牛，其作用較之以前，大大減小，.其結果就是牦

6、牛數(shù)量的銳減，數(shù)量銳減不可避免地導致遺傳多樣性的喪失，這一現(xiàn)象已經引起眾多專家的廣泛關注。問題是一口了然的，現(xiàn)在看似沒有優(yōu)勢的個體，包含了我們日后育種所必須的基因。我們可以利用其優(yōu)良性狀的基因培育更加優(yōu)質的品種，使其具冇高產、抗病能力強以及較強適應性的特點，從而使生產力大大提高。此次研究便是針對我國四川省甘孜縣野牦牛的P-乳球蛋白基兇的5”凋控區(qū)序列的遺傳多樣性，采用PCR擴增技術和序列測序的方法進行了一系列的研究，為后續(xù)進行遺傳多樣性的保護以及以核苷酸序列為基礎的進化、分類等的研究進行材料的積累和條件的創(chuàng)造。2材料與方法2.1材料2.1.1樣品廿孜野牦牛肌肉組織樣品，兩

7、份樣品均采自四川省廿孜藏族自治區(qū)廿孜縣東郊一屠宰場。2.1.2試劑和儀器1、儀器設備：電子分析天平、pH計、移液器、手提式不銹鋼高壓滅菌鍋、電熱恒溫水浴鍋、制冰機、微波爐、冰箱、電泳槽、電泳儀、凝膠電泳成像儀、臺式離心機、雙模塊梯度PCR儀、超浄工作臺、紫外分光光度計、恒溫培養(yǎng)搖床、霉菌培養(yǎng)箱2、常規(guī)儀器：平板、酒精燈、接種環(huán)、玻璃棒、1.5mL、2mL、150PL離心管等。3、菌株，酶及試劑盒等：宿主菌DH5a,pMD18-TVector、蛋0酶K、瓊脂糖、EB、6xLoadingbuffer、DNAMarker(1200b