紫莖澤蘭多糖的免疫調(diào)節(jié)活性研究

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1、主題策劃FEATURE紫莖澤蘭多糖的免疫調(diào)節(jié)活性研究12萬春燕,周緒斌(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100093;2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆烏魯木齊830032)摘要：紫莖澤蘭是多年生草本或亞灌木。20世紀(jì)40年代由緬甸傳入中國云南后，迅速在西南地區(qū)擴(kuò)散，破壞了植物的群落結(jié)構(gòu)、畜牧業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。通過研究紫莖澤蘭提取物中的多糖成分，首次發(fā)現(xiàn)其具有免疫活性。為研究紫莖澤蘭多糖（EAP）的免疫調(diào)節(jié)作用，試驗(yàn)用4個(gè)不同劑量的紫莖澤蘭多糖50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL和400μg/mL刺激人源（A549）細(xì)胞和鼠源（RAW264.7）細(xì)胞，分別作用12h，24h和

2、36h，用熒光定量PCR測定細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL-6）,腫瘤壞死因子（TNF-α）,干擾素（IFN-β和IFN-γ）的表達(dá)情況，結(jié)果表明EAP濃度為200μg/mL，作用時(shí)間為36h時(shí)這4種細(xì)胞因子的表達(dá)水平都較高。對于免疫佐劑的開發(fā)或免疫調(diào)節(jié)劑的研制具有重要作用。關(guān)鍵詞：紫莖澤蘭多糖；免疫；細(xì)胞因子1紫莖澤蘭多糖的提取50,100,200,400μg/mL，另外設(shè)脂多糖（LPS）組，每個(gè)梯取100?g陰涼處干燥的紫莖澤蘭葉片，將葉片剪碎，輾度3個(gè)重復(fù)?？瞻讓φ占尤?00?μL相應(yīng)的磷酸緩沖（PBS）液。成粉，40目過濾篩過濾。再將其溶于1?000?mL蒸餾水中，3)培養(yǎng)12?h,2

3、4?h,36?h每個(gè)濃度取3個(gè)樣品，提取細(xì)胞于超聲波提取裝置中提取40?min，收集上清液，沉淀物再懸總RNA，采用熒光定量PCR方法檢測紫莖澤蘭多糖的免疫浮于1000?mL蒸餾水，再次通過超聲處理提取30?min，將得相關(guān)細(xì)胞因子IL-6，TNF-α,IFN-β，IFN-γ等。到的上清液與前一次所得合并，最后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將水相3.2采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物合蒸發(fā)至干，得到的殘留物溶解在蒸餾水中，并在4℃下冷凍成cDNA保存。3.3熒光定量PCR2紫莖澤蘭多糖的純化制備用β-actin作為內(nèi)參。獲得的實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)用將萃取液在3?000?g/min離心25?

4、min，80?℃下進(jìn)行濃縮2-ΔΔCT方法分析相關(guān)基因的表達(dá)。8?h，以制備多糖，將上清液用Sevag法脫蛋白。必要時(shí)可用3.4數(shù)據(jù)分析紫外分光光度計(jì)測?250～280?nm沒有吸收峰方可確定除凈了使用GraphPad?Prism?V5.01作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P蛋白。將上層清液用2?mol/L?氫氧化鈉調(diào)至pH=7，加熱回流＜0.05為差異顯著，在圖中用“*”表示。用1%活性炭脫色。4結(jié)果取除雜蛋白后的溶液10?mL,裝入截留分子量為4.1紫莖澤蘭多糖對人源細(xì)胞（A549）的免疫調(diào)節(jié)作用8?000～15?000的透析袋中透析脫鹽及小分子雜質(zhì)，透析液4.1.1不同濃度的EAP對A549

5、細(xì)胞的影響離心（3?000?r/min,10?min），上清于80?℃水浴濃縮至原體實(shí)驗(yàn)選取的紫莖澤蘭多糖濃度分別為50μg/mL、積的1/3。然后加入4倍體積95％乙醇（v/v）沉淀24?h后，100μg/mL、200?μg/mL和400μg/mL，分別作用于離心（3?000?r/min,15min），沉淀用無水乙醇洗滌2次，乙A549細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用相對熒光定量醚洗滌1次，真空干燥得紫莖澤蘭多糖樣品。PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用苯酚-濃硫酸分光光度法測醇mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明在200μg/mL時(shí)4種細(xì)

6、胞因子沉淀物中的EAP糖含量。的表達(dá)量都較高（P＜0.05）。3紫莖澤蘭多糖對人源細(xì)胞和鼠源細(xì)胞的免疫調(diào)EAP終濃度分別為50?μg/mL、100μg/mL、200μg/節(jié)作用mL和400μg/mL，LPS對照的濃度為50?ng/mL，PBS組3.1多糖的處理為陰性對照。從圖1中可以看出，IL-6、TNF-α、IFN-β1）將提取的紫莖澤蘭多糖溶于蒸餾水中，經(jīng)0.45?μm和IFN-γ在EAP濃度為200?μg/mL時(shí)其mRNA的表達(dá)和0.22μm的過濾器過濾，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋；都顯著提高（P＜0.05）。EAP濃度200μg/mL與其他濃度2)將T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的人源（A549）細(xì)

7、胞和鼠相比提高效果最明顯。源（RAW264.7）細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)液使其4.1.2不同時(shí)間點(diǎn)EAP對A549細(xì)胞的影響最終體積為20?mL，向6孔培養(yǎng)液中加入2?mL/孔，同實(shí)驗(yàn)選取了紫莖澤蘭多糖濃度為200?μg/mL，分別作時(shí)加入紫莖澤蘭多糖溶液200?μL/孔，使其最終濃度為用時(shí)間12?h、24?h和36?h于A549細(xì)胞，提取RNA，反54豬業(yè)科學(xué)??SWINE?INDUSTRY?SCIENCE??2014年?第1