肉雞鼠傷寒沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

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1、基礎(chǔ)研究中國畜牧獸醫(yī)文摘2014年30卷第11期肉雞鼠傷寒沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗蔣勇軍（揚州市廣陵區(qū)沙頭鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣服務(wù)站，江蘇揚州225105）沙門氏菌病是家禽的一種常見病與高發(fā)病，給家禽養(yǎng)殖業(yè)化特征。造成了較大的危害。沙門氏菌感染不僅引起家禽發(fā)病死亡造成嚴(yán)2.4　PCR鑒定[3]重的經(jīng)濟(jì)損失，且易污染家禽產(chǎn)品，成為沙門氏菌的攜帶者。參考相關(guān)文獻(xiàn)針對沙門菌腸毒素stn基因設(shè)計如目前，從家禽和禽產(chǎn)品中分離出沙門氏菌的報道明顯多于其它動下引物，目的片段大小為260bp。上游引物P1：5′-

2、物，造成這一結(jié)果的主要原因是由于沙門氏菌在被感染的家禽中CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′，下游引物P2：5′-能通過水平傳播和垂直傳播造成廣泛流行，同時，也反映出家禽TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′；無菌挑取菌落作為模板，PCR體系為[1]的飼養(yǎng)數(shù)量十分龐大。目前，全球已知的沙門氏菌血清型超過25μl，擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃1min、55℃1min、了2500種，分屬不同的血清群，不同血清型沙門氏菌的鑒定具有72℃1min，25個循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)

3、物經(jīng)瓊脂糖凝膠流行病學(xué)意義。而與禽類感染密切相關(guān)沙門氏菌主要包括引起雞電泳檢測。結(jié)果見圖1，所擴(kuò)增的DNA片段大小約為260bp，和預(yù)白痢或禽傷寒的雞白痢沙門菌與雞傷寒沙門菌，引起禽副傷寒多期片段大小一致。表明分離菌為沙門菌。種血清型（以腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌為代表），以及引[3]起火雞亞利桑那病的部分血清型。雛禽對沙門菌較為易感，感染后通常具有較高的死亡率。多年生產(chǎn)實踐表明，由于缺乏效果確實的疫苗，因而該病的預(yù)防和治療主要依賴于敏感抗生素，但由于抗生素在臨床的長期不合理使用導(dǎo)致耐藥菌株的不斷

4、增多，使得此病防治變得較為困難。因此，在臨床實踐中對沙門氏菌分離菌株的耐藥情況進(jìn)行監(jiān)測，具有非常重要的意義。1　試驗背景2014年1月，在江蘇省揚州市沙頭鎮(zhèn)某肉雞養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的雛雞在15日齡開始陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病和死亡情況，使用恩諾沙星等藥物給予治療，疫情有所好轉(zhuǎn)，但未能根治，平均死亡率超過20%。發(fā)病雛雞主要表現(xiàn)為體形瘦小、精神萎頓、羽毛松亂、吃料減少或食欲廢絕、排淡黃綠色至綠色稀糞、并粘污肛門周圍的羽毛。剖檢圖1分離菌株的stn基因擴(kuò)增結(jié)果病變主要表現(xiàn)為心包炎、肝脾腫大、膽囊充盈，部分雞只肝臟有M.DN

5、AMarkerDL2000；1.陰性對照2.分離菌stn基因擴(kuò)增條帶白色結(jié)節(jié)等。為確診，找出治療該次疫情的藥物，特進(jìn)行了本試2.5　血清學(xué)分型驗。在潔凈的玻片上滴加1滴沙門氏菌屬診斷血清（購自寧波天潤2　細(xì)菌分離與鑒定生物藥業(yè)有限公司），將分離菌加入少量滅菌生理鹽水中制成濃2.1　病料采集與培養(yǎng)菌液，然后取少量菌液滴到血清中，混合均勻2min內(nèi)判定結(jié)果?，F(xiàn)場無菌采集發(fā)病雞的心血、肝臟、脾臟、膽囊、胰腺、腦同時設(shè)生理鹽水的對照。Ｏ抗原鑒定：用A-F多價Ｏ血清進(jìn)行玻組織、盲腸內(nèi)容物等病料，無菌操作取待檢

6、病料接種分別接種麥板凝集試驗，同時，設(shè)生理鹽水作為對照，陽性凝集者依次用康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板和營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～48Ｏ4、Ｏ9、Ｏ7、Ｏ8、Ｏ10、Ｏ2和Ｏ11因子血清進(jìn)行凝集試驗。根h，結(jié)果，從死亡雞的組織臟器中分離到1株疑似細(xì)菌。該分離菌據(jù)試驗結(jié)果，判定分離菌O抗原型。H抗原鑒定：取疑似菌依次用在麥康凱平板上生長出無色、透明菌落，在SS平板上生長出無色H多價血清進(jìn)行鑒定，對于陽性者，再用對應(yīng)的H復(fù)合血清及H單透明菌落，部分菌落中心有黑點，在營養(yǎng)瓊脂上生長出無色透明因子血清逐一檢

7、查，以確定H第一相及第二相H抗原。H抗原成分[4]菌落，初步判斷為沙門氏菌。的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果。2.2　顯微鏡觀察結(jié)果表明，分離菌與沙門氏菌Ｏ4因子血清發(fā)生凝集反應(yīng)，與將可疑沙門氏菌單菌落經(jīng)涂片固定后，置高倍顯微鏡下觀其他Ｏ因子血清不凝集，可以判定該分離菌株屬于沙門氏菌B群。察，顯示分離菌為長短不一、兩端鈍圓、兩極著色、呈直線形的進(jìn)一步對H抗原的檢測結(jié)果表明，分離菌分別與Hi和H1、2發(fā)生凝革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培集反應(yīng)。查閱卡夫曼-懷特沙門

8、菌抗原表，判定該分離菌為鼠傷寒養(yǎng)12～20h培養(yǎng)后保存?zhèn)溆?。沙門菌。2.3　生化試驗2.6　藥敏試驗取分離菌的24h純培養(yǎng)物分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗（葡萄糖、乳挑取純化好的菌落加入少量滅菌生理鹽水中制成濃菌液，以糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽利用試驗麥?zhǔn)媳葷峁転閷φ照{(diào)整菌液濃度為0.5個單位，將上述菌液均勻涂與硫化氫試驗等，結(jié)果表明分離菌株能分解葡萄糖、甘露醇、麥布在MH瓊脂平板上，分別貼上各種藥敏紙片，37℃培養(yǎng)22～24h芽糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不利用乳糖和蔗