探討胸苷激酶基因在垂體腺瘤治療中的作用機(jī)制

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1、探討胸苷激酶基因在垂體腺瘤治療中的作用機(jī)制　　垂體腺瘤通常為良性腫瘤，約占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的15%.　　垂體腺瘤可導(dǎo)致相關(guān)激素的過度分泌和占位效應(yīng)，從而引發(fā)多種臨床癥狀。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，生長(zhǎng)激素（GH）mRNA在垂體細(xì)胞中嚴(yán)格表達(dá)且轉(zhuǎn)錄活性較高,而單純皰疹病毒胸苷激酶（HSVGTK）與更昔洛韋共同作用已被證實(shí)可殺死多種腫瘤細(xì)胞。本文探討TK基因在垂體腺瘤治療中的作用及其機(jī)制。　　1材料和方法　　　　1.1實(shí)驗(yàn)材料　　　　垂體生長(zhǎng)激素腺瘤細(xì)胞系GH3由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。腺病毒載體AdGHTK

2、表達(dá)試劑盒購(gòu)自上海吉馬制藥技術(shù)有限公司，核苷類似物更昔洛韋購(gòu)自湖北科益藥業(yè)股份有限公司。兔源多克隆HSVGTK抗體、HRP標(biāo)記的goatantiGrabbitIgG購(gòu)自北京博奧森公司。非放射性細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢天源生物技術(shù)有限公司?！　?.2實(shí)驗(yàn)方法　　1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用含有體積分?jǐn)?shù)0.05磷酸鹽緩沖液（PBS）的Optimem培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)GH3細(xì)胞。待細(xì)胞增殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于以下研究?！　?.2.2TK基因表達(dá)檢測(cè)應(yīng)用免疫印跡法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1.5109/L的密

3、度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后,按感染復(fù)數(shù)（MOI）為10PFU/cell轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照組替換成等量PBS溶液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,使用PBS沖洗細(xì)胞兩次，再將細(xì)胞置于0.3mL的緩沖液中。將樣品在干冰乙醇浴中冷卻后置于37℃水浴，重復(fù)3次。4℃離心20min,上清液置于-70℃?！　×呀饧?xì)胞，提取蛋白，十二烷基硫酸鈉G聚丙烯酰胺（SDSGPAGE）凝膠電泳后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上；用含50g/L脫脂奶粉的TBST常溫封閉2h后,加入一抗兔源多克隆HSVGTK抗體（1∶800）,4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗10min

4、共3次后，加入二抗HRP標(biāo)記的goatantiGrabbitIgG,常溫1h;TBST緩沖液漂洗10min共3次;顯色，壓片，顯影，定影?！　?.2.3更昔洛韋敏感性檢測(cè)應(yīng)用非放射性細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，測(cè)定轉(zhuǎn)染過腺病毒的細(xì)胞對(duì)更昔洛韋的敏感性。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以4106/L的密度接種于96孔板中，然后按不同的MOI（0、1、5、10、100和500PFU/cell）轉(zhuǎn)染腺病毒載體。轉(zhuǎn)染16h后，吸取病毒溶液，PBS清洗細(xì)胞，再添加不同濃度的更昔洛韋（0、1、5、10mg/L），每隔2d添加一次含有更昔洛韋的培養(yǎng)液。在添加更昔洛

5、韋后的第4天測(cè)定細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=給予更昔洛韋細(xì)胞的吸光度/未給予更昔洛韋細(xì)胞的吸光度?！　?.2.4旁觀者效應(yīng)將轉(zhuǎn)染了AdGHTK的GH3細(xì)胞和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的GH3細(xì)胞分別以1∶4、2∶3、3∶2和4∶1的比例混合后，以4106/L的密度接種于96孔板中。培養(yǎng)1d后,其中一組加入濃度為10mg/L的更昔洛韋作為實(shí)驗(yàn)組，另一組加入等量PBS作為對(duì)照組，每隔2d添液一次。4d后檢測(cè)細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率=（細(xì)胞總數(shù)-死亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)100%.　　1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　　應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，

6、計(jì)量資料結(jié)果用x±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析及成組設(shè)計(jì)的方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！　?結(jié)果　　　　2.1TK基因的表達(dá)　　AdGHTK轉(zhuǎn)染組有兩條明顯的蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量分別為42000和46000;而對(duì)照組則僅有1條帶，相對(duì)分子質(zhì)量為42000（圖1）。TK基因已轉(zhuǎn)染入GH3細(xì)胞，并成功表達(dá)。【圖1】　　2.2TK基因?qū)Ω袈屙f敏感性影響　　不同更昔洛韋濃度細(xì)胞存活率比較，差異有顯著性（F=148160.215,P<0.001）;不同MOI濃度細(xì)胞存活率差異

7、亦有顯著性（F=275838.795,P<0.001）;更昔洛韋濃度和MOI濃度間存在著顯著的交互效應(yīng)（F=14245.000,P<0.001）.當(dāng)MOI濃度為0時(shí),細(xì)胞存活率不隨更昔洛韋濃度的變化而變化；當(dāng)MOI濃度為1~500PUF/cell時(shí),細(xì)胞存活率隨更昔洛韋濃度的增加而降低；當(dāng)MOI濃度為10PUF/cell時(shí),更昔洛韋濃度為1mg/L就產(chǎn)生細(xì)胞毒性（細(xì)胞存活率明顯下降）；當(dāng)更昔洛韋濃度為10mg/L時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生完全毒性（細(xì)胞死亡率接近100%）.轉(zhuǎn)染細(xì)胞存在明顯的敏感性。在高濃度MOI（100、50

8、0PUF/cell）下，即使更昔洛韋劑量很低，也會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。見表1.【表1】　　2.3旁觀者效應(yīng)　　未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活率為（98.51±2.16）%,1∶4混合轉(zhuǎn)染組為（51.32±2.34）%,2∶3混合轉(zhuǎn)染組為（11.23±2.07）%