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1、氨基胍對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響【關(guān)鍵詞】氨基胍骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡兔誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 ABSTRACT:ObjectiveToobservetheeffectofaminoguanidinebyintraperitonealinjectiononapoptosisofchondrocyte.Boththeexperimentandthemodelgroupsb,ent.Theexperimentgroupsinoguanidineinabdominalcavity,100mg/(kg·d),andthecontrolgr
2、oupsevoluminalnormalsalineinabdominalcavity.Atthe4ththenormalgroup,and6fromthecontrolgroupandtheexperimentgroup,respectively.Atthe8thaterialsfromeachsampleforpathologicalobservationontheicroscopebyHEandimmunohistochemicalstaining,andcountedapoptosiscellsbyTUNELforstat
3、isticalanalysis.ResultsparedentgrouporesimilartothenormalgroupingeneralobservationandopticalmicroscopeobservationbyHEstaining.BothiNOSpositiveexpressioncellbyimmunohistochemicalstainingandapoptosiscellcalculationbyTUNELoftheexperimentgroupinoguanidineinjectedinabdomin
4、alcavitycandepresstheproductionofiNOS,decreaseapoptosisofthecartilagecell,anddelayorpreventprogressionofOA. KEYinoguanidine;osteoarthritis;chondrocyte;apoptosis;rabbit;iNOS 骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種老年常見(jiàn)慢性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其重要的病理學(xué)特征是關(guān)節(jié)軟骨的降解(包括軟骨細(xì)胞的數(shù)量減少和細(xì)胞外基質(zhì)降解)。早期缺乏有效
5、的特異性治療方法，往往因癥狀加重而需行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)?，F(xiàn)研究證明，OA患者體內(nèi)一氧化氮(nitricoxide,NO)濃度升高。過(guò)高的NO可影響關(guān)節(jié)軟骨的代謝，造成軟骨細(xì)胞凋亡增多。氨基胍(aminoguanidine,AG)是一種選擇性的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)抑制劑，本實(shí)驗(yàn)使用AG干預(yù)兔OA模型，觀察關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)變化及軟骨細(xì)胞凋亡，旨在探討治療OA的新途徑?！ ?材料與方法 1.1材料健康成熟日本大耳白兔32只，體重2.2-2.5kg，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)
6、動(dòng)物中心提供。氨基胍硫酸鹽由美國(guó)Sigma公司購(gòu)得，iNOS免疫組化染色一抗購(gòu)自博士德生物工程有限公司，二抗及堿性磷酸酶購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL法)購(gòu)自美國(guó)羅氏公司?！ ?.2實(shí)驗(yàn)分組32只兔子隨機(jī)分為正常組、模型組和氨基胍組。后兩組行右后肢伸直位管型石膏固定造模,自由活動(dòng)，正常喂養(yǎng)。氨基胍組腹腔內(nèi)注射氨基胍硫酸鹽溶液100mg/(kg·d)，模型組每天腹腔內(nèi)注射相同體積的生理鹽水，正常組不予任何處理。密切觀察動(dòng)物，有石膏松動(dòng)跡象時(shí)，予以修復(fù)，牢靠固定?！ ?.3形態(tài)觀察及HE染色4、8周時(shí)采用
7、空氣栓塞法分別處死各組半數(shù)動(dòng)物，取右后肢股骨髁進(jìn)行大體標(biāo)本病理學(xué)觀察后，用40g/L多聚甲醛固定，100g/LEDTA脫鈣液脫鈣，制備切片，HE染色?！ ?.4TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡切片二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水，30mL/L過(guò)氧化氫處理10min，用蛋白酶K于37℃消化15min，滴加25μL的TUNEL反應(yīng)混合溶液(含末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶TDT及含有核苷酸混合液)，在濕盒中37℃孵育60min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。陽(yáng)性對(duì)照：在切片置TUNEL反應(yīng)混合溶液前，先在200ng/mLDNaseⅠ(DNA聚合酶Ⅰ)溶液
8、中37℃下反應(yīng)15min；陰性對(duì)照標(biāo)記時(shí)不加TDT，其余步驟相同?！ ?.5iNOS的免疫組化染色切片二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水，30mL/L過(guò)氧化氫甲醇沖洗，磷酸鹽緩沖液沖洗，1.25g/L胰蛋白酶消化。加入10mL/L牛血清白蛋白，20℃孵育
