rna干擾技術(shù)抑制乳腺癌skbr3細胞her2的

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1、RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌SKBr3細胞HER2的【摘要】構(gòu)建含表皮生長因子受體2基因(HER2)的短發(fā)夾狀雙鏈RNA(shRNA)重組質(zhì)粒,體外觀察對人乳腺癌細胞SKBr3的HER2mRNA及蛋白表達的影響。方法利用分子克隆技術(shù),將含HER2的雙鏈DNA,與經(jīng)雙酶切后的載體pSilencer連接,構(gòu)建pSilencerHER2重組質(zhì)粒,在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染高表達HER2的乳腺癌細胞系SKBr3。RTPCR分析HER2mRNA的表達,TT法測定細胞增殖情況。結(jié)果酶切鑒定證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染后能明顯抑制HER2mRNA及蛋白的表達,抑制細胞的

2、增殖。結(jié)論構(gòu)建的pSilencerHER2重組質(zhì)粒能有效地降低人乳腺癌細胞HER2的表達,抑制細胞的增殖,為HER2高表達預(yù)后不良的乳腺癌基因治療提供新策略。【關(guān)鍵詞】RNA干擾受體表皮生長因子乳腺腫瘤瘤細胞培養(yǎng)的基因表達表皮生長因子受體2(HER2)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種上皮源性腫瘤中過度表達,與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等關(guān)系密切[1],是極具發(fā)展前途的基因治療靶位。約有30％乳腺癌患者伴隨有HER2及其基因產(chǎn)物的過表達[2],HER2過表達是乳腺癌病人不良預(yù)后的重要標記物。RNA干擾是近年來發(fā)展起來的基因阻斷技術(shù),它通過將雙鏈RNA(doub

3、lestrandedRNA,dsRNA)導(dǎo)入細胞后,在Dicer酶的作用下產(chǎn)生有活性的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA),與該段RNA同源mRNA產(chǎn)生特異性降解,從而導(dǎo)致特異基因表達抑制的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象[3]。筆者采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制人乳腺癌細胞株SKBr3細胞HER2的表達,探討利用質(zhì)粒表達載體體內(nèi)合成siRNA的方法能否有效介導(dǎo)腫瘤細胞出現(xiàn)RNAi，從而為乳腺癌的基因治療提供新策略。1材料和方法1.1材料1.1.1細胞株SKBr3細胞(人乳腺癌細胞株，湖南遠泰生物技術(shù)有限公司)。1.1.2主要

4、試劑MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶(立陶宛MBI公司);質(zhì)粒pSilencerTM3.1H1neo(美國Ambion公司);限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4DNA連接酶、100bpDNAladder(大連寶生物技術(shù)公司);RMPI1640培養(yǎng)基、Trizol和Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司);MTT(美國Sigma公司);鼠抗人HER2單克隆抗體(美國RD公司);TMB004448),按照siRNA的設(shè)計原則,利用Ambion公司在線設(shè)計軟件設(shè)計siRNA序列,篩選出1個19核苷酸的靶序列,用

5、siRNAHairpin寡核苷酸序列設(shè)計軟件設(shè)計成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu),雙鏈的5’端引入BamHⅠ位點,3’端引入HindⅢ位點,中間9個核苷酸是用于形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),在3’端有一個TTTTTT的終止信號。DNA正義鏈：5’GATCCGGACATCTTCCACAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTGTGGAAGATGTCCTTTTTTGGAAA3’DNA反義鏈：3’GCCTGTAGAAGGTGTTCTTGAAGTTCTCTCAAGAACACCTTCTACAGGAAAAAACCTTTTCGA5’由大連寶生物工程公司合成,2條DNA鏈退火形成雙鏈DNA

6、,與線性化載體在16℃連接過夜,無義對照質(zhì)粒由美國Ambion公司提供,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。隨機挑選轉(zhuǎn)化菌落,小量提取質(zhì)粒,進行酶切鑒定,鑒定正確的shRNA重組質(zhì)粒(pSilencerHER2)進行測序。1.2.2細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞SKBr3,用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)和傳代。1.2.3細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1d,將SKBr3細胞接種6孔板,每孔3×105,3mL,置37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,待細胞生長融合達85%~90%后,采用siPORTXP1試劑(美

7、國Ambion公司)按說明書方法進行轉(zhuǎn)染,每孔加入脂質(zhì)體2.0μL和重組質(zhì)粒pSilencerHER21.0μg,同時轉(zhuǎn)染無義質(zhì)粒(pSilencerneospecial)作為對照。轉(zhuǎn)染48h后檢測目的基因的表達。1.2.4RTPCR檢測HER2基因表達用Trizol按說明書方法抽提轉(zhuǎn)染48h后細胞總RNA,用紫外分光光度計定量,經(jīng)MMlv酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Primerpremier6.0軟件設(shè)計引物,HER2引物：上游:5’CCATCAAAGTGTTGAGGGAAAAC3’下游:5’AATCTGCATACACCAGTTCAGC

8、A3’PCR產(chǎn)物778bp,內(nèi)參照GAPDH引物：上游:5’GGTGAAGGTCGGAGTCAACG3’下游:5’