rna干擾技術抑制ec109細胞survivi

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1、RNA干擾技術抑制EC109細胞survivi【摘要】目的：應用RNA干擾技術（RNAi）研究針對survivin基因的siRNA，抑制survivin基因的表達并誘導食管癌細胞系EC109細胞的凋亡.方法：構建針對survivin的siRNA表達質粒，轉染至EC109細胞，熒光顯微鏡判斷轉染效率，蛋白質印跡和半定量RTPCR檢測survivin蛋白表達及基因轉錄水平的變化，并在不同時間點收集轉染細胞，利用流式細胞術及基因組DNA凋亡檢測試劑盒，觀察siRNA抑制survivin基因表達后誘導細胞凋亡的情況.結果：熒光顯微鏡結果表明，重組質粒轉染效率達46.70％.半定量RT

2、PCR檢測到pSIREN/S質粒在EC109細胞內對survivin基因的轉錄抑制率為74.04%；蛋白質印跡結果表明，轉染重組質粒pSIREN/S的EC109細胞survivin蛋白表達量僅為正常組的41.64%，而對照質粒pSIREN/對survivin基因的蛋白表達及轉錄均沒有抑制作用.經pSIREN/S轉染的EC109細胞基因組DNA出現(xiàn)明顯的DNAladder，流式細胞儀分析結果也顯示凋亡細胞為60.78%.結論：survivin特異性siRNA可明顯抑制survivin基因的轉錄和表達，并能有效地誘導EC109細胞的凋亡，為下一步在體內利用pSIREN/S重組質

3、粒沉寂survivin基因，促腫瘤細胞的凋亡提供實驗基礎.【關鍵詞】RNA干擾技術食管腫瘤survivin基因EC109細胞　　0引言　　潮汕地區(qū)是中國六大食管癌高發(fā)區(qū)之一，據統(tǒng)計，廣東省南澳縣惡性腫瘤死因構成的排位順序為食管癌最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的半數(shù)以上［1］.因此對于食管癌特別是中晚期患者，尋找有效的治療手段至關重要.survivin是IAP（inhibiteapoptosisprotein）家族成員之一，具有抑制凋亡的作用；同時也是細胞周期調節(jié)蛋白，通過干擾細胞的有絲分裂以調節(jié)細胞的凋亡［2］.已有文獻［3-5］報道，食管癌患者的腫瘤組織中survivin的表達明顯高于

4、正常組織，我們利用siRNA技術，以食管癌EC109細胞株為模型，利用survivin特異性siRNA，對survivin基因的轉錄、表達及其誘導EC109細胞凋亡進行了研究.　　1材料和方法　　1.1材料　　人食管鱗癌細胞株EC109為汕大醫(yī)學院沈忠英教授饋贈.大腸桿菌DH5α及RNAi載體質粒RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpression購自Invitrogen公司.RPMI1640、小牛血清、胰蛋白酶等購自Sigma公司.脂質體Lipofectamine2000購自Invitrogen公司.兔抗人survivin單抗購自SantaCruze

5、，CY3標記的羊抗兔IgGFc抗體購自武漢博士德公司.限制性核酸內切酶EcoRI，BamHI等購自NEB公司.T4DNA連接酶、DL2000標準Marker由TaKaRa公司提供.質粒提取試劑盒購自上海博光生物技術有限公司.RNaeasyKit購自Qiagen公司.　　1.2方法　　1.2.1抑survivinsiRNA序列及載體構建　　根據survivin的編碼序列及以往的研究資料，結合siRNA序列設計原則并利用Blast進行查詢，確定其為特異性survivinRNA干擾的靶序列,其正義鏈:5′gatccaaagcattcgggttgcttcaagacggcaaccggacga

6、atgctttttttttgaattca3′,反義鏈:3′agcttgaattcaaaaaaaaagcattcgtccggttgccgtcttcaagcaaccggacgaatgctttg5′.為排除siRNA本身的影響，我們設計了無關的siRNA序列，序列，即正義鏈為：5′gatccgacttcataaggcgcatgcttcaagacggcatgcgccttatgaagtcttttttgtcgaca3′，反義鏈為：3′gctgaagtattccgcgtacgaagttctgccgtacgcggaatacttcagaaaaaacagctgttcga5′.所有的寡核苷酸片段均

7、由上海生工生物工程技術服務有限公司合成.退火后分別插入經BamHI和EcoRI線性化的載體pSIREN中，構建重組載體pSIREN/S和pSIREN/.轉化大腸桿菌DH5α，挑取氨芐青霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)，然后快速小量制備質粒并進行核酸測序鑒定，選擇序列正確的克隆擴大培養(yǎng).　　1.2.2細胞培養(yǎng)與轉染EC109細胞株常規(guī)培養(yǎng)于　　RPMI1640培養(yǎng)基中，每2～3d經2.5g/L的胰酶消化，傳代培養(yǎng).采用LipofectamineTM2000(Invit