蜂毒素對肝癌細(xì)胞bel7402的增殖抑制作用

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1、蜂毒素對肝癌細(xì)胞BEL7402的增殖抑制作用【關(guān)鍵詞】蜂毒素；肝細(xì)胞癌；增殖；細(xì)胞增殖核抗原；細(xì)胞周期　　Abstract:［Objective］TostudytheinhibitionofmelittinonproliferationofhepatocellularcarcinomacelllineBEL7402.［Methods］BEL7402celllineelittin.Theproliferationinhibitionetry.［Results］Melittincoundsig

2、nificantlyinhibitthegroelittinacelllineBEL7402andreduceofPApositivecellexpressionandarrestcellsinSphase.　　Keya;proliferation;proliferatingcellnuclearantigen;cellcyclephase　　蜂毒素是蜜蜂毒的主要成分，既往我們實驗室對蜂毒素的提取、純化及抗腫瘤作用進(jìn)行了多年研究，探索了一些提取、純化蜂毒素的方法［12］，初步發(fā)現(xiàn)蜂毒素抗腫瘤

3、起效快、作用強［37］。在此基礎(chǔ)上，本實驗進(jìn)一步觀察蜂毒素對肝癌細(xì)胞BEL7402的增殖抑制效果及作用機制，為蜂毒素抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供部分實驗依據(jù)?！　?材料與方法　　1.1實驗材料　　1.1.1藥物蜂毒素為長海醫(yī)院中醫(yī)科實驗室通過AKTA蛋白純化工藝開拓系統(tǒng)層析提取、純化，冷凍干燥后分裝備用?！　?.1.2細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株BEL7402由長海醫(yī)院中醫(yī)科實驗室保存，用含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期

4、細(xì)胞進(jìn)行實驗?！　?.2實驗方法　　1.2.1增殖抑制率測定BEL7402細(xì)胞以1.5×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，實驗組加入終濃度為2、4、8、16、32、64及128μg的蜂毒素培養(yǎng)12h和24h，每孔加MTT20ml繼續(xù)培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150ml，震蕩混勻，10min后于酶聯(lián)儀上以波長490nm測定光密度值，按下列公式計算細(xì)胞增殖抑制率：　　細(xì)胞增殖抑制率=（1實驗組光密度值/對照組光密度值）×100%　　1.2.2增殖核抗原的檢測

5、取指數(shù)生長期BEL7402細(xì)胞，以5×105細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔體積分?jǐn)?shù)為2ml，常規(guī)培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的蜂毒素處理細(xì)胞，另設(shè)空白對照，每組設(shè)3個復(fù)孔，于處理后24h，收集細(xì)胞，離心，PBS洗滌2次，用70%冷乙醇2ml（4℃）固定，經(jīng)1500轉(zhuǎn)離心5min，棄去乙醇，PBS洗滌2次，用終濃度為0.02%的TritonX100預(yù)處理20min后，用FITC標(biāo)記的PA單抗直接染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠IgG2a作同型對照，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。　　1.2.3肝癌細(xì)胞

6、周期的檢測碘化丙錠（PI）染液的配制：PI50μg/ml，0.02％TritonX100，Rnase100μg/ml。BEL7402細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，分別加入32μg/ml和16μg/ml的蜂毒素，另設(shè)空白對照組。于處理后24h，收集細(xì)胞，70%乙醇固定，4℃過夜，PI染液避光染色30min，流式細(xì)胞儀測定各細(xì)胞周期所占百分比?！　”?蜂毒素對BEL7402細(xì)胞增殖核抗原的影響（略）　　*P<0.05vs對照組；**P<0.01vs對照組?！　?.3

7、不同濃度蜂毒素對肝癌細(xì)胞周期的影響見表3。經(jīng)蜂毒素處理后，肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期均受到不同程度的影響，S期細(xì)胞比例相對增多，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）?！　”?蜂毒素對BEL7402肝癌細(xì)胞周期的影響（略）　　*P<0.01vs對照組　　3討論　　惡性腫瘤細(xì)胞異常增殖是其特征之一，有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，是抗腫瘤藥物的重要要求之一。本研究采用MTT法，評價本實驗室采用中壓液相色譜分離、純化的蜂毒素的抗腫瘤生物活性。結(jié)果表明，蜂毒素在體外對肝癌細(xì)胞BEL740

8、2的增殖具有一定的抑制作用?！　≡鲋承约?xì)胞核抗原又稱周期蛋白（cyclin），首先由Miyachi提純，其分子量在33KD～36KD之間，它是一種非組蛋白核內(nèi)多肽，是DNA合成的特殊輔酶［8］，其含量反映了細(xì)胞增殖的程度。PA作為DNA聚合酶的復(fù)合因子，有調(diào)節(jié)DNA合成的功能，也可參與非程序化的DNA合成，在細(xì)胞增殖過程中有重要意義［910］。本實驗采用流式細(xì)胞儀的方法測定了蜂毒素對肝癌細(xì)胞PA的影響，結(jié)果顯示蜂毒素可減少肝癌細(xì)胞的PA表達(dá)，而蜂毒素對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用可能與其抑制PA的表