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《金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶的功能研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、中文摘要摘要金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一類(lèi)應(yīng)用廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌，在昆蟲(chóng)防治中起著重要作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，真菌殺蟲(chóng)劑盡管安全，無(wú)環(huán)境污染，但存在著殺蟲(chóng)速率緩慢的弱點(diǎn)，這在很大程度上阻礙了真菌殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用。對(duì)昆蟲(chóng)病璦真菌致病機(jī)制進(jìn)行研究可為發(fā)展新型高效真菌殺蟲(chóng)劑提供依據(jù)。海藻糖是一種非還原性二糖，存在于所有己知種類(lèi)的昆蟲(chóng)中，是昆蟲(chóng)血淋巴中主要的糖類(lèi)(大約占80—90％)。海藻糖在昆蟲(chóng)血液生理中起著重要的作用，其耗竭可能對(duì)昆蟲(chóng)起著致命性的作用。蟲(chóng)生真菌侵染進(jìn)入昆蟲(chóng)血腔后，昆蟲(chóng)血淋巴中的海藻糖成為真菌生長(zhǎng)
2、主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但海藻糖對(duì)許多真菌來(lái)說(shuō)是非滲透性二糖，必須在相應(yīng)的二糖水解酶作用下分解為葡萄糖才能被真菌利用。金龜子綠僵菌侵染進(jìn)入昆蟲(chóng)血淋巴后，能分泌酸性海藻糖酶，有效地降解昆蟲(chóng)血淋巴中的海藻糖。因此酸性海藻糖酶在真菌對(duì)昆蟲(chóng)的致病過(guò)程中起著重要的作用。目前對(duì)真菌酸性海藻糖酶的研究較少，只有少數(shù)幾個(gè)物種的酸性海藻糖酶基因被克隆并測(cè)定序列。在蟲(chóng)生真菌中，除了本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道己純化出金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶和獲得該基因序列，還未見(jiàn)其他酸性海藻糖酶方面的報(bào)道。但是綠僵菌天然酸性海藻糖酶表達(dá)量少、不穩(wěn)定、純化步驟繁瑣、成本高，不利于進(jìn)一步研究酸性海
3、藻糖酶。本研究以金龜子綠僵菌(Manisopliae)菌株CQMal02為研究材料，結(jié)合RACE等技術(shù)手段，成功分離出綠僵菌酸性海藻糖酶基因全序列并登錄NCBI的GenBaak，登錄號(hào)為：EFl90950(eDNA序列)。同時(shí)在畢赤酵母中成功表達(dá)綠僵菌酸性海藻糖酶，并與綠僵菌天然的酸性海藻糖酶進(jìn)行酶學(xué)特性比較。此外，根據(jù)該基因序列構(gòu)建了綠僵菌酸性海藻糖酶RNA干擾載體，獲得3個(gè)RNAi轉(zhuǎn)化子。研究結(jié)果為進(jìn)一步利用基因工程手段改造病原真菌、提高生物防治效果奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：1．利用已知片段，結(jié)合RACE等技術(shù)手段分離出綠僵菌
4、酸性海藻糖酶基因，其GenBank登錄號(hào)為EFl90950(eDNA序列)。酸性海藻糖酶似TMl)DNA序列含有3個(gè)內(nèi)含子，其開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼一個(gè)含1073個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該酸性海藻糖酶具有一個(gè)20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列和含有30個(gè)可能的N，糖基化位點(diǎn)(Asn-Xaa-Ser／Thr)。NCBI序列比對(duì)(Blastn)顯示該蛋白與Aspergillusfumigatus的alpha,alpha-trehaloseglucohydrolase，Aspergilluanidulans的酸性海藻糖酶前體和Talaromycesemr
5、sonii的酸性海藻糖酶分別有62％、59％和57％的氨基酸相似性；同時(shí)與另外兩個(gè)真菌Saccharomycescerevisiae(Athlp)和Candidaalbicans(Atelp)的酸性海藻糖酶也具有約25％的氨基酸相似性。重慶大學(xué)博士學(xué)位論文2．構(gòu)建重組表達(dá)畢赤酵母菌株KM71／ATMl，并篩選出高效表達(dá)CQMal02酸性海藻糖酶的畢赤酵母菌株KM71／ATMl(pPATMl．21)。在0．5％甲醇誘導(dǎo)48個(gè)小時(shí)后，pPATMl—21菌株分泌酸性海藻糖酶達(dá)到最高蜂5．35units／mgprotein(352units／
6、liter)。利用PCR技術(shù)，在構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-ATMl時(shí)，在ATMl序列的C．端引入組氨酸標(biāo)簽，一步Ni親和層析純化出酸性海藻糖酶(reATMlp)。3．ReATMlp酶學(xué)特性分析：該蛋白為糖蛋白，等電點(diǎn)4．9，分子量170KDa；Trehazolin是其特異性抑制劑，其Ic50為1．9×10{M；海藻糖為該蛋白專(zhuān)一性底物，其最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)pH為6．0；該酸性海藻糖酶特征米式常數(shù)(Km)為2．6mM，最大酶促反應(yīng)速度(Vmax)為0．305mmolmin。1mg—protein。4．根據(jù)ATMl基因序列構(gòu)建
7、了金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶的RNA干擾載體，利用基因槍法，轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌CQMal02，經(jīng)過(guò)PCR篩選和Southernblot驗(yàn)證，獲得3個(gè)RNAi轉(zhuǎn)化子。3個(gè)RNA干擾菌株(RAl4，RA42和RA74)ATMl的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比野生型的分別下降了98．84％，98．57％和96．56％。關(guān)鍵詞：金龜子綠僵菌，酸性海藻糖酶，畢赤酵母，特性，基因克隆，真菌轉(zhuǎn)化，RNA干擾II英文摘要AbstractMetarhiziumanisopliae，aspeciesofentomopathogenicfungiwidelyapplied
8、athomeandabroad，playsanimportantroleinbiologicalcontrolofinsects．Comparedwithchemicalinsecticides，mycoinseetic
