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《金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗特異表達(dá)基因》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗特異表達(dá)基因篩選與體內(nèi)定殖階段cDNA文庫(kù)構(gòu)建本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目編號(hào)：No:30771446重慶大學(xué)博士學(xué)位論文學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師：玉先教授專(zhuān)業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)科門(mén)類(lèi)：工學(xué)重慶大學(xué)生物工程學(xué)院二OO九年四月IdentificationofGenesDifferentiallyExpressedbyMetarhiziumanisopliaeInfectLocustamigratoriaandConstructionofcDNALibraryfromMetarhiziumanisopliaeintheHemolymphofLocustamigra
2、toriaTheresearchwassupportedbygrantfromtheNaturalScienceFoundationofChina.No:30771446AThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofDoctorofEngineeringBySupervisedbyyYYyProf.導(dǎo)師***Major:BiomedicalEngineeringCollegeofBioengineeringOFChongqingUniversity,Ch
3、ongqing,ChinaApril,2009中文摘要摘要金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）是一類(lèi)重要的昆蟲(chóng)病原真菌，在害蟲(chóng)生物防治中起著重要作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，昆蟲(chóng)病原真菌開(kāi)發(fā)的真菌殺蟲(chóng)劑作用時(shí)間持久、無(wú)環(huán)境污染、對(duì)非靶標(biāo)生物安全，但存在致死時(shí)間長(zhǎng)，殺蟲(chóng)效率低，防效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了真菌殺蟲(chóng)劑的廣泛應(yīng)用，為解決這一問(wèn)題，在分子水平上揭示昆蟲(chóng)病原真菌致病機(jī)理尤為重要。金龜子綠僵菌侵染寄主昆蟲(chóng)時(shí)，分生孢子在體表萌發(fā)形成附著胞，并分泌多種蛋白酶類(lèi)降解昆蟲(chóng)體壁，附著胞的形成與分化在侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。金龜子綠僵菌直接穿透寄主體壁進(jìn)入體內(nèi)，在血淋巴定
4、殖，以掠奪寄主營(yíng)養(yǎng)或分泌毒素使寄主死亡，能否在體內(nèi)成功定殖決定著侵染的最終結(jié)果。篩選附著孢形成時(shí)期和血淋巴定殖階段的特異表達(dá)基因和基因表達(dá)分析對(duì)于研究昆蟲(chóng)病原真菌致病機(jī)理具有重要意義。EST序列分析和微陣列技術(shù)是研究昆蟲(chóng)病原真菌致病機(jī)理的成功策略，國(guó)內(nèi)外許多研究者通過(guò)這種策略對(duì)綠僵菌侵染昆蟲(chóng)致病機(jī)理進(jìn)行了深入研究，但采用的方法均是離體條件下，在各種液體培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物培養(yǎng)，然后構(gòu)建綠僵菌cDNA文庫(kù)，大規(guī)模測(cè)序，進(jìn)行EST序列分析。很明顯，這些技術(shù)路線有一定的局限性，綠僵菌在離體液體培養(yǎng)環(huán)境下處于腐生生長(zhǎng)階段，而綠僵菌侵染昆蟲(chóng)過(guò)程處于寄生生活階段，離體條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)和事實(shí)的侵染
5、過(guò)程差別明顯，很難對(duì)綠僵菌穿透寄主體壁機(jī)制，定殖寄主血淋巴適應(yīng)機(jī)制作出完整的詮釋?zhuān)瑥亩U明病原真菌和寄主的相互作用關(guān)系。本研究以金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株CQMa102和東亞飛蝗（Locustamigratoria）為研究對(duì)象，從寄主血淋巴中分離出無(wú)寄主核酸污染的綠僵菌菌體，以已降解寄主核酸的東亞飛蝗翅膀誘導(dǎo)附著孢形成與分化，利用抑制消減雜交技術(shù)（SSH）篩選綠僵菌在附著胞形成時(shí)期和定殖血淋巴階段的差異表達(dá)基因。DSN均一化和SMART技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了金龜子綠僵菌CQMa102定殖東亞飛蝗血淋巴階段的全長(zhǎng)均一化cDNA文庫(kù)，大規(guī)模測(cè)序，進(jìn)行ES
6、T序列分析，分析綠僵菌定殖寄主血淋巴階段的基因表達(dá)特征，以闡明寄主和病原物之間的相互作用關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：1．觀察了金龜子綠僵菌CQMa102在實(shí)驗(yàn)條件下侵染東亞飛蝗的致病過(guò)程：發(fā)現(xiàn)24h左右分生孢子穿透寄主表皮進(jìn)入血淋巴，接觸血細(xì)胞，引起血細(xì)胞聚集；3天～6天大量的芽生孢子被血細(xì)胞吞噬、包囊；在寄主昆蟲(chóng)死亡前24h左右，血細(xì)胞數(shù)量急劇減少，芽生孢子開(kāi)始迅速繁殖，血淋巴內(nèi)懸浮著大量酵母狀蟲(chóng)菌體101中文摘要（hyphalbody）。2．根據(jù)寄主血細(xì)胞和病原真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)差別，建立和完善了利用蛋白酶K和SDS迅速裂解寄主血細(xì)胞的方法，整個(gè)流程時(shí)間約40min，RT-PCR檢測(cè)表
7、明，利用寄主血細(xì)胞裂解釋放的內(nèi)源RNases和PBS洗滌可高效去除蟲(chóng)菌體中的寄主核酸污染，這一結(jié)論也被后續(xù)EST序列分析所證明。3.以寄主體內(nèi)分離，去除寄主核酸污染的綠僵菌菌體提取mRNA為實(shí)驗(yàn)組（tester），使用RNAfragmentationbuffer處理東亞飛蝗翅膀，降解寄主核酸，并誘導(dǎo)附著孢形成與分化，以該時(shí)期的菌體提取mRNA為驅(qū)動(dòng)組（driver），進(jìn)行抑制消減雜交（suppressionsubtractivehybridization,SSH），篩選出350個(gè)
