金釵石斛遺傳多樣性研究的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)dna

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1、金釵石斛遺傳多樣性研究的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA作者：王燕燕徐紅魏丹紅王崢濤【摘要】目的對(duì)影響金釵石斛隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）-PCR擴(kuò)增效果的一些因素進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步研究其遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。方法對(duì)金釵石斛RAPD分析中一些重要影響因素進(jìn)行比較系統(tǒng)的構(gòu)建和優(yōu)化，建立金釵石斛RAPD穩(wěn)定可靠的反應(yīng)體系。結(jié)果金釵石斛較適宜的RAPD-PCR反應(yīng)條件為：10μlPCR反應(yīng)體系中，5～20ng模板DNA，3.0mmol·L-1Mg2+，0.34mmol·L-1dNTPs，0.6UTaqDNA聚合酶，1.5μmol·L-1引物，較適宜的退火溫度為36℃。結(jié)論所建立的金釵石斛RAPD反應(yīng)體系具有標(biāo)記位

2、點(diǎn)清晰、反應(yīng)系統(tǒng)穩(wěn)定、檢測(cè)多態(tài)性能力較強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于金釵石斛的遺傳多樣性研究。以該優(yōu)化的RAPD條件進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性良好。【關(guān)鍵詞】金釵石斛；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA反應(yīng)體系；優(yōu)化　　Abstract：ObjectiveToestablishandoptimizeRAPDPCRsystemofD.nobileLindl.MethodsThereliableRAPD-PCRsystemforthegeicdiversitystudyofD.nobileLindl.establishedbysystematicallytestingandoptimizingtheimportantc

3、oncentrationsofthefactors.ResultsTheconditionsthatcontained5～20ngtemplateDNA,3.0mmol·L-1Mg2+,0.34mmol·L-1dNTPs,0.6UTaqDNApolymeraseand1.5μmol·L-1prime.ThesuitableannealingtemperatureintheRAPD-PCRreactionsystem,orphicmolecularmarkers,stablereactionsystem,andissuitableforstudyingthegeicdiversityofD.no

4、bileLindl..Theexperimentresultsarereproduciblebasedonthisconditions.　　Key;Optimization　　金釵石斛DendrobiumnobileLindl.又稱金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草、黃草，為蘭科(Orchidaceae)石斛屬DendrobiumSAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)技術(shù)是由g2+濃度、dNTP濃度、Taq酶濃度、引物濃度、退火溫度等影響RAPD反應(yīng)的諸因素進(jìn)行了構(gòu)建和優(yōu)化，建立多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的金釵石斛RAPD反應(yīng)體系，為進(jìn)一步研究金釵石斛的遺傳多樣性、開(kāi)發(fā)利用這一珍稀藥用

5、資源提供技術(shù)支持?！　?材料與儀器　　1.1材料金釵石斛，新鮮材料于2005年采自云南文山縣，現(xiàn)保存于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，材料經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所徐紅博士鑒定原植物學(xué)名?！　?.2儀器PTC-200型PCR儀（MJResearch公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)PharmaciaBiotech）；電泳儀（Bio-Rad）；核酸蛋白分析儀（美國(guó)Beckman）；離心儀（美國(guó)Beckman）?！　?.3試劑CTAB、β-巰基乙醇、TrisBalancedPhonel、Tris、EDTA、瓊脂糖均為分析純；10×PCRbuffer,TaqDNApolymerase(Taq酶),MgCl2,dN

6、TPs試劑購(gòu)于上海生工公司；RAPD引物采用的為適于進(jìn)行金釵石斛RAPD擴(kuò)增的隨機(jī)引物，由上海生工公司提供?！　?方法　　2.1總DNA的提取采用改良的CTAB法。取新鮮葉片約1.2g，用雙蒸水洗凈，加液氮手工研磨成細(xì)粉，迅速轉(zhuǎn)移至4個(gè)10ml離心管中，加入已65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液5ml，混勻，65℃保溫2～4h，期間多次輕輕顛倒混勻，使DNA提取充分；待提取液冷卻至室溫，加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)抽提10min，12000r·min-1，離心10min，吸取上清液，再用1/3體積的苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)抽提10min，12000r·min-1，離心

7、10min，吸取上清液，加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)萃取液，上下多次顛倒，萃取充分直至兩相間無(wú)白色中間層，12000r·min-1，離心10min，吸取上清液，加1/2體積的異丙醇，1/10體積的3mol·L-1NaAc，混勻，-20℃放置0.5～1h，12000r·min-1，4℃，離心10min，棄液，70%乙醇洗滌沉淀物2次(4℃，12000r·min-1，離心5min)，揮干至無(wú)醇味