佛手種質(zhì)資源遺傳多樣性的隨機擴增多態(tài)性dna分析論文

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1、佛手種質(zhì)資源遺傳多樣性的隨機擴增多態(tài)性DNA分析論文【摘要】目的研究佛手種質(zhì)資源多樣性和遺傳關(guān)系。方法采用隨機擴增多態(tài)性隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)分析了佛手13份種質(zhì)材料的親緣關(guān)系。結(jié)果從110條引物中篩選出16條多態(tài)性高的引物，共擴增出185條DNA帶，其中多態(tài)性帶有168條，多態(tài)率為90.8%。通過聚類分析，在相似系數(shù)0.67的水平上將13份材料分為3類。結(jié)論佛手種質(zhì)間存在較豐富的遺傳多樣性，聚類結(jié)果與以產(chǎn)地為依據(jù)對佛手進行品種類群劃分較為一致。【關(guān)鍵詞】佛手隨機擴增多態(tài)度性DNA分析遺傳多樣性佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylis(Noot.

2、)SedicaL.var.sarcodactylis(Noot.)San-15CSR冷凍高速離心機；PCR儀(AppliedBiosystems2720Thermalcycler)；UVPGDS7600型凝膠成像儀；ECANSpectraFLUORplus多功能酶標儀。大連寶生物DR001AMPCR擴增試劑盒；上海生工隨機引物；上海生工進口分裝瓊脂糖；上海申能博彩3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒；天為時代DNAMarker(200bpDNALadderplus)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。表1樣品來源（略）1.3方法1.3.1佛手總DNA的提取和檢測采用上海申能博彩公司的3s柱離心

3、式植物基因組DNA試劑盒提取。將提取到的DNA用純水稀釋10倍后，用酶標儀分別測定其在260，280nm處的吸收值，計算出OD260與OD280的比值及DNA濃度，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果的優(yōu)劣。1.3.2佛手RAPD反應(yīng)體系和擴增程序在對佛手PCR擴增體系優(yōu)化后，確定反應(yīng)的總體積為25μl，包括：MgCl22μl(25mmol/L)，引物1.5μl(10μmol/L)，dNTPs2μl（2mmol/L），10×buffer緩沖液3μl，0.3μlTaq酶（5U/μl），60ngDNA樣品。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min,35℃退火lmin,7

4、2℃延伸1.5min，40次循環(huán)，最后72℃延伸10min，－20℃保存。1.3.3引物篩選選取德慶、青衣童子兩種地理位置差異較大的DNA樣品做模板，用110個引物(S1～S100,.freeler引物對供試的13份材料進行PCR擴增，統(tǒng)計結(jié)果見表2。16個引物共擴增出185條帶，其中多態(tài)性帶有168條，占90.8%；平均每個引物可擴增出11.6條帶，平均每份材料可擴增出14.2條帶，擴增的譜帶分子量大小在300～2200bp；各個引物間擴增的位點數(shù)相差較大，不同引物的擴增帶數(shù)變幅從6～15條不等，其中擴增帶數(shù)最多的引物為S23，具15條擴增帶，最少的為引物S6，僅具6條擴增帶，說明不

5、同引物與供試材料總基因組DNA部分區(qū)域的同源性具有較大的差異。部分引物的擴增結(jié)果見圖1。表216個引物的擴增結(jié)果（略）2.3聚類分析13份供試材料的Nei遺傳相似系數(shù)矩陣如表3所示，經(jīng)聚類分析構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖（圖2）。相似系數(shù)分布在0.58～0.89之間，說明佛手種質(zhì)的遺傳多樣性較為豐富。供試材料在相似系數(shù)為0.67處分為3個類群，第1類群包括Sn1，Sn2，Sn3和Sn4，第2類群包括Sn5，Sn6，Sn7和Sn8，第3類群包括Sn9，Sn10，Sn11，Sn12和Sn13。表313份佛手種質(zhì)資源的相似系數(shù)矩陣（略）圖中對應(yīng)的各個泳道的品種順序相同，從左到右依次為Sn1～Sn8，D

6、NAMarker(200bpDNALadderplus)，Sn9～Sn13，陰性對照圖1引物S24，S31，S80，S220的RAPD擴增圖譜（略）3討論本研究應(yīng)用RAPD技術(shù)對佛手種間親緣關(guān)系進行了闡明，來源不同的13份種質(zhì)的遺傳多樣性高達90.8%，表明佛手現(xiàn)有的種質(zhì)遺傳變異較大，從而構(gòu)成了較為豐富的種質(zhì)資源基因庫，說明佛手遺傳基礎(chǔ)廣，具有較大的育種潛力和較強的進化能力，這與佛手栽培歷史悠久和種植范圍較廣有關(guān)。圖2基于RAPD分析產(chǎn)生的佛手種質(zhì)資源聚類圖（略）供試材料在相似系數(shù)為0.67處分為3個類群，這與按照產(chǎn)地的不同將佛手分為廣佛手、浙佛手和川佛手的劃分一致。第1類群和第3類群

7、中各種質(zhì)之間的親緣較近，這與它們在植物學(xué)形態(tài)上差異不大的情況相吻合。第2類群中4個栽培品種雖然在植物學(xué)形態(tài)上差異較大，但由于生長環(huán)境相同，在相似系數(shù)0.75處聚為一類，親緣關(guān)系也較近，可能是遺傳基因和環(huán)境相互作用的結(jié)果；其中，Sn8為Sn5的芽變選育品種，兩者在形態(tài)上有較大的差異，但分子水平上證明其遺傳關(guān)系較近；Sn6和Sn7兩者在葉片、花、果等植物學(xué)形態(tài)上差異較大，但其相似系數(shù)為0.78，表明其親緣關(guān)系較近，形態(tài)上的差異并未在分子水平上反映。