螺旋腺瘤臨床病理分析螺旋腺瘤臨床病理分析

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1、螺旋腺瘤臨床病理分析螺旋腺瘤臨床病理分析【摘要】目的:研究高密度殼聚糖（highdensitychitosan，HDC）對小鼠L929細胞的毒性，以期為其臨床安全應用提供依據(jù)。方法：觀察不同濃度HDC浸提液對體外培養(yǎng)L929細胞形態(tài)的影響，四甲基偶氮唑藍（methlthiazolyltetrazolium,MTT）實驗評價HDC對L929細胞生長和增殖的影響，流式細胞術（floetry，F(xiàn)CM）檢測HDC浸提液對L929細胞凋亡的影響，單細胞凝膠電泳（singlecellgelelectrophores

2、is,SCGE）檢測不同濃度HDC浸提液對培養(yǎng)的L929細胞DNA分子損傷的影響。結果：HDC浸提液對體外培養(yǎng)的L929細胞形態(tài)無明顯影響，對細胞生長和增殖無明顯抑制作用,不同濃度材料浸提液的細胞毒性均為01級；FCM示凋亡率隨浸提液濃度升高而升高，但不明顯;SCGE結果顯示HDC對L929細胞的DNA無明顯損傷作用。結論：HDC具有良好的細胞相容性和分子相容性，可為臨床的安全應用提供依據(jù)?！娟P鍵詞】高密度殼聚糖分子生物相容性單細胞凝膠電泳殼聚糖是一種可被降解吸收、具備良好生物相容性的高分子材料，具有多

3、種作用[12]。其衍生物高密度殼聚糖（highdensitychitosan，HDC）由于還可被應用于填補骨缺損、治療骨折及具比殼聚糖更明顯的降血脂等作用而受到重視，并成為醫(yī)學工作者研究熱點之一，但其相容性評價鮮見報道。隨著生物材料相容性研究逐漸向分子水平的邁進，生物材料評價逐漸進入整體、細胞和分子水平的全面評價階段。為確保生物材料臨床應用的安全性,本研究擬通過形態(tài)學觀察、四甲基偶氮唑藍（methlthiazolyltetrazolium,MTT）實驗、流式細胞術（floetry，F(xiàn)CM）檢測和單細胞凝膠電泳

4、（singlecellgelelectrophoresis,SCGE）來研究HDC浸提液對L929細胞的影響，進而評價HDC毒性、細胞相容性和分子相容性，期望能為其臨床安全應用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料HDC(上海優(yōu)品生物有限公司提供，脫乙酰度90%),L929細胞株(購自中科院上海細胞研究所)，RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO公司提供），MTT（美國SIGMA公司提供），低熔點瓊脂糖（南京生興生物技術有限公司提供），熒光顯微鏡（日本Nikon公司提供）。1.2實驗方法1.2.1HDC浸提液制備

5、和實驗分組1.2.1.1HDC浸提液制備HDC經(jīng)紫外照射滅菌后，按試樣0.15g·ml-1的質量濃度，在37℃、72h條件下，浸提后過濾除菌保存?zhèn)溆?，浸提介質為含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基。1.2.1.2實驗分組(1)陰性對照組,RPMI1640培養(yǎng)液組；(2)～(5)25%、50%、75%、100%HDC浸提液組；(6)陽性對照組，0.7%聚丙烯酰胺單體(PVC)（SCGE實驗陽性組為0.01mol·L-1H2O2組）。1.2.2HDC的毒性研究1.2.2.1細胞形態(tài)觀察0.25%胰酶消化對數(shù)生長期

6、的L929細胞，傳代后用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液及不同濃度(25%、50%、75%、100%)HDC浸提液培養(yǎng)細胞，然后分別于12、24、72h倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞貼壁情況并拍照。（1）無毒：細胞形態(tài)正常，貼壁生長好，細胞呈梭形或不規(guī)則三角形。（2）輕度毒性：細胞貼壁生長好，但可見少數(shù)細胞圓縮，偶見懸浮細胞。（3）中度毒性：細胞貼壁生長不佳，細胞圓縮較多，達1/3以上，見懸浮死細胞。（4）重度毒性：細胞基本不貼壁，90%以上為懸浮死細胞。1.2.2.2MTT實驗實驗以RPMI1640

7、培養(yǎng)液稀釋100%浸提液至所需濃度。將L929細胞復蘇、傳代后,于對數(shù)生長期經(jīng)胰蛋白酶消化制成6×104ml-1的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，24h后換液，72h后加入MTT，4h后加入二甲基亞砜(DMSO),震蕩10min后在免疫酶標儀上測定493nm處光密度(opticaldensity,OD)值。計算細胞增殖率(relativegrowthrate,RGR或proliferationrate，PR)。RGR(%)=實驗組OD均值／陰性對照組OD均值×100%。根據(jù)RGR進行細胞毒性分級:99≤RGR≤

8、100時，細胞毒性為0級；75≤RGR<99時，細胞毒性為1級；50≤RGR<75時，細胞毒性為2級；25≤RGR<50時，細胞毒性為3級；1≤RGR<25時，細胞毒性為4級；0≤RGR<1時，細胞毒性為5級。0級和1級被認為沒有細胞毒性，2級為輕度細胞毒性或結合細胞形態(tài)綜合評價，3級和4級為中度細胞毒性，5級為明顯的細胞毒性，35級為不合格材料。1.2