人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成軟骨誘導(dǎo)研究

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1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成軟骨誘導(dǎo)研究【摘要】目的：研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs）在體外培養(yǎng)過(guò)程中的增殖和成軟骨分化現(xiàn)象和規(guī)律。方法：以密度梯度離心法分離健康成人髂骨MSCs，觀察體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)和增殖現(xiàn)象。取第三代細(xì)胞給予地塞米松，維生素C和不同劑量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforminggroenonandruleofmultiplicationandchondrogenesisofmesenchymalstemcells(MSCs)derivedfromhumanbon

2、emarroIliumandpurifiedbydensitygradient.Toobservetheconformation,groultiplicationofMSCsculturedinvitro.SCsandinducedthemintochondrogenicdifferentiationethasone，VitaminCandTGF-β1indifferentdosageformedchondracytesinduction.After3easuredthesulfateglycosaminoglycanmunoflu

3、orescenceandglycosaminoglycanetry.Results：MSCscanbeculturedostevidentexpression.Conclusion：MSCshavestrongabilityofmultiplicationandcouldbeinducedintochondrocytesundercertaincircumstances.TGF-β1isthemajorfactorofchondrogenesisesenchymalstemcells;chondrogenesis;TGF-β1　　各

4、種由創(chuàng)傷和疾病引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床上十分常見(jiàn),目前臨床上尚無(wú)有效的治療方法。近年來(lái)組織工程技術(shù)的發(fā)展給修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損帶來(lái)了希望。最近的比較研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs)是修復(fù)全層軟骨缺損的最佳細(xì)胞源［1］。筆者采集健康人骨髓，以密度梯度離心法分離人MSCs，行體外培養(yǎng)擴(kuò)增及成軟骨誘導(dǎo)，希望為臨床治療軟骨缺損提供參考?！　?材料與方法　　1.1對(duì)象　　骨髓標(biāo)本取自3名健康成年男性自愿者（28，34，37歲）髂后上棘。3人均無(wú)全身性疾病和代謝性疾病。取得知情同意后，無(wú)菌條件下抽取骨髓

5、5ml置于抗凝環(huán)境?！　?.2主要試劑　　L-DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（民海生物公司），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1（美國(guó)Peprotech公司），維生素C、地塞米松、胰蛋白酶、硫酸軟骨素（Sigma公司），人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll（天津?yàn)笊锕荆每谷硕湍z原多克隆抗體、濃縮型Cy3-SABC免疫熒光試劑盒（博士德公司）?！　?.3人MSCs的分離和體外培養(yǎng)　　取2.5ml骨髓加入等量PBS稀釋?zhuān)荡蚧靹?，貼壁緩慢加入已有5mlFicoll分離液的離心管。2000r/min離心20min，吸取界面

6、云霧狀白膜層（富含MSCss）。加入PBS,800r/min離心10min洗滌2遍，計(jì)數(shù)。以5×106/cm2接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基）。培養(yǎng)48h后半量換液，棄去不貼壁的雜細(xì)胞。以后2～3d換液1次，7～10d即可見(jiàn)較多貼壁細(xì)胞。細(xì)胞90％融合時(shí)0.25％胰酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)三代后MSCs基本純化。取第三代細(xì)胞按1×105/cm2接種96孔板，于傳代后8d內(nèi)每天取10孔行MTT檢測(cè)，繪制傳代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線?！　?.4成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)　　配制成軟骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基①～④號(hào)：完

7、全培養(yǎng)基加地塞米松（10-8mol/L）,TGF-β1（0，5，10，20μg/L）、維生素C（10mmol/L）。取長(zhǎng)勢(shì)良好的第三代MSCs，分4組（命名為A,B,C,D）分別按1×105/cm2接種于含條件培養(yǎng)基①～④號(hào)的24孔板（每組12孔）。每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。另取4個(gè)6孔板，按1×105/cm2接種長(zhǎng)勢(shì)良好的第三代MSCs，分別用條件培養(yǎng)基①～④號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)3周，用以檢測(cè)蛋白多糖（proteoglycan，PG）含量?！　?.5軟骨細(xì)胞檢測(cè)　　定向誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，用4%低聚甲醛固定24孔板中細(xì)胞20min后行以

8、下檢測(cè)。（1）甲苯胺藍(lán)染色：用70%乙醇、濃度為0.2%甲苯胺藍(lán)染色1min，再以95%的乙醇分色10min，純丙酮脫水2次，每次5min，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。（2）阿利新藍(lán)染色：用pH2.5的阿利新藍(lán)染色30min，蒸餾