原代大鼠邊緣群肝細(xì)胞的分離及端粒酶活性分析

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1、原代大鼠邊緣群肝細(xì)胞的分離及端粒酶活性分析作者：劉海亮竇科峰李韌李霄張福琴【摘要】　　目的：通過(guò)檢測(cè)端粒酶活性（TMA）在原代大鼠邊緣群及非邊緣群肝細(xì)胞中表達(dá)差異，探討邊緣群細(xì)胞是否具有肝臟干細(xì)胞的部分特征.方法：原位兩步膠原酶法分離大鼠肝細(xì)胞.應(yīng)用流式熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)將肝細(xì)胞分成邊緣群（SP）及非邊緣群(NonSP)，并定量分析兩群細(xì)胞中TMA水平.結(jié)果：存在SP細(xì)胞并占細(xì)胞總體2.1%，SP細(xì)胞TMA高于NonSP細(xì)胞（28.1±1.3vs2.0±0.2TPG，P<0.01）.結(jié)論：大鼠邊緣群肝細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力，即具有干細(xì)胞的部分特征.【關(guān)鍵詞

2、】肝細(xì)胞大鼠邊緣群端粒酶干細(xì)胞0引言干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞.端粒酶活性在多數(shù)正常體細(xì)胞中不表達(dá)，而在胚胎細(xì)胞、造血干細(xì)胞、精原細(xì)胞中有表達(dá).我們利用流式熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)對(duì)原代大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)是否也可以將正常大鼠肝細(xì)胞分成對(duì)熒光染料具有不同排出特性的邊緣群(sidepopulation,SP)和非邊緣群，并檢測(cè)端粒酶活性(telomeraseactivity,TMA)的表達(dá)差異，以探索邊緣群肝細(xì)胞是否具有更強(qiáng)的自我更新能力這一干細(xì)胞特性.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠(

3、第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、IV型膠原酶(Invirtrogen)、胎牛血清(杭州四季青)、HEPES、Hoechst33342(Sigma).TRAPezeXL端粒酶檢測(cè)試劑盒(Chemicon).FACSAdvantageII型六色熒光流式細(xì)胞儀（BD公司）,BX51免疫熒光顯微鏡（Olympus公司）,PCR擴(kuò)增儀(Eppendof公司),RF5000熒光分光光度計(jì)（日本島津）,EPS2Z200垂直電泳儀(Amersham)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1大鼠肝細(xì)胞分離按Dunn等［1］法并略加改進(jìn).雄性SD大鼠5只，體質(zhì)量180~200g，用20g/L戊巴

4、比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，固定、消毒，股靜脈注射肝素1000U，開腹顯露門靜脈后在距肝門1cm處插入22G套管針，連接蠕動(dòng)泵，以30mL/min速率灌入4℃預(yù)冷的前灌注液(含0.2g/LEDTA,15mmol/LHEPES的HBSS)，剪開下腔靜脈放出血液，10min后換為38℃預(yù)熱的后灌注液（含5mmol/LCa2+,15mmol/LHEPES,0.5g/LⅣ型膠原酶的HBSS），以15mL/min灌注10min.將肝臟取下放入12cm培養(yǎng)皿中，加入4℃的HBSS，冰上操作去除肝包膜，鈍性撕裂肝組織.兩層紗布過(guò)濾，將細(xì)胞懸液在4℃下50g離心3min，棄上清，重復(fù)洗滌

5、2次.4g/L臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算肝細(xì)胞存活率.將肝細(xì)胞沉淀重懸于含100mL/L胎牛血清、10nmol/L胰島素、100nmol/L地塞米松、105U/L青霉素、100μg/L鏈霉素的培養(yǎng)液中，以1×108個(gè)/L密度接種3個(gè)25mL培養(yǎng)瓶，24h換液，計(jì)算肝細(xì)胞貼壁率.1.2.2SP細(xì)胞及NonSP細(xì)胞的檢測(cè)及分選①細(xì)胞染色：調(diào)整肝細(xì)胞懸液密度為1×109個(gè)/L.HBSS洗滌，制備成單細(xì)胞懸液.等分細(xì)胞懸液，兩組均加入熒光染料Hoechst33342，使終濃度為6mg/L，其中一組再加入維拉帕米，終濃度5mmol/L.37℃避光水浴90min，冰上10min終止染色，冰預(yù)冷HBSS

6、洗滌細(xì)胞并重懸浮.再加入PI使終濃度為2mg/L.②流式細(xì)胞儀檢測(cè)：355nmUV激發(fā)光源，610nm雙色短通反射濾鏡，450nm和675nm邊緣長(zhǎng)通濾片分別檢測(cè)散射光藍(lán)光及紅光部分，線性模式采集信號(hào).測(cè)量前向散射和側(cè)向散射二維參數(shù)圖，檢測(cè)細(xì)胞均一性，以HoechstRed為X軸，HoechstBlue為Y軸作二維散點(diǎn)圖，將低HoechstRed及低HoechstBlue且維拉帕米組缺失的區(qū)域設(shè)定為SP細(xì)胞的“門”（gate），計(jì)算百分比.分選出SP細(xì)胞及NonSP細(xì)胞.1.2.3SP細(xì)胞及NonSP細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)①細(xì)胞處理及PCR：取SP和NonSP細(xì)胞各105個(gè)，依照

7、TRAPezeXL端粒酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞處理.PCR反應(yīng)條件：30℃孵育30min，94℃30s,59℃30s,72℃1min進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，72℃3min延伸，然后是55℃25min，終止于4℃.②熒光分光光度計(jì)檢測(cè)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：設(shè)置熒光素的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為495nm/516nm，硫氰酸鹽的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為600nm/620nm，分別記錄每個(gè)樣本在兩種激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光值，并根據(jù)試劑盒要求計(jì)算出每個(gè)樣本的TMA值.③100mL/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳