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《大鼠肝細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)的簡(jiǎn)易方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、222江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(JiangsuJ.ofAgr.Sci.),2009,25(1):222～224大鼠肝細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)的簡(jiǎn)易方法劉學(xué)忠,李慧敏,王富民,顧建紅,劉宗平(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州225009)關(guān)鍵詞:大鼠;肝細(xì)胞;分離;原代培養(yǎng);鑒定中圖分類(lèi)號(hào):Q2233文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100024440(2009)0120222203ASimplifiedMethodforSeparationandPrimaryCultureofRatHepatocytesLIUXue2zhong
2、,LIHui2min,WANGFu2min,GUJian2hong,LIUZong2ping(CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)Keywords:rat;hepatocyte;isolation;primaryculture;identification體外分離培養(yǎng)肝細(xì)胞是人工肝、毒理學(xué)、藥理學(xué)、生理學(xué)113鼠尾膠原制備及培養(yǎng)板包被以及基因工程等研究的基礎(chǔ),良好的分離技術(shù)是獲取高活性11311鼠
3、尾膠原制備取SD大鼠1只,剪斷鼠尾,置75%[1]肝細(xì)胞的前提。長(zhǎng)期以來(lái),國(guó)內(nèi)外普遍采用Seglen的膠原乙醇中浸泡30min,于無(wú)菌條件下將鼠尾切成115cm左右酶原位兩步灌流法,該法成為分離肝細(xì)胞的經(jīng)典方法,在此的小段,剝?nèi)テっ?抽出尾腱置于平皿中,剪碎以后浸入150[2]基礎(chǔ)上又發(fā)展了半原位酶分離技術(shù)。但該類(lèi)方法仍存在ml011%醋酸溶液中,4℃冰箱中放置48h,并不時(shí)振蕩。操作繁瑣、流程長(zhǎng)、膠原酶耗費(fèi)大等問(wèn)題。本研究擬采用胰4000r/min離心30min,吸取上清,經(jīng)67155kP(1
4、1516℃)酶、膠原酶兩步消化法獲取肝細(xì)胞,以求操作簡(jiǎn)便,膠原酶用高壓滅菌10min后分裝,-20℃保存?zhèn)溆?。量?并能滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)肝細(xì)胞的要求。11312培養(yǎng)板包被取少許膠原加到培養(yǎng)板中,不宜太厚,放到高壓過(guò)的鋁盒中,通入氨氣作用15min取出培養(yǎng)板,用1材料與方法無(wú)菌生理鹽水沖洗,置紫外燈下過(guò)夜。111試驗(yàn)動(dòng)物114大鼠肝細(xì)胞分離及培養(yǎng)出生3d的SD大鼠(揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。11411肝細(xì)胞分離出生3d的SD大鼠斷頭處死放入112主要試劑及儀器75%乙醇中消毒10min,無(wú)菌條件
5、下取肝臟,置冰冷PBS中,鼠尾膠原(自制);DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(杭撕去肝包膜,剪碎后先加入0105%的胰酶,37℃振蕩消化20州四季青);胰酶(上海生工,1∶250);IV型膠原酶(Worthing2min,棄去上清后再用0105%的IV型膠原酶37℃振蕩消化ton,280U/mg);堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、過(guò)碘酸(上海生20min,分別用120目、200目網(wǎng)篩過(guò)濾,細(xì)胞懸液在4℃條工);二氧化碳培養(yǎng)箱(Healforce);高速冷凍離心機(jī)(Jouan/件下800r/min離
6、心3min,反復(fù)離心3次。沉積的細(xì)胞用含5MR23i)、倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠);XL302ESEM環(huán)境10%胎牛血清的DMEM調(diào)整細(xì)胞密度為1ml5×10個(gè)細(xì)掃描電子顯微鏡(Philips)。胞,臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定肝細(xì)胞活力。11412肝細(xì)胞原代培養(yǎng)調(diào)整好密度的細(xì)胞接種在膠原包被的培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h后換液,去掉紅細(xì)胞。收稿日期:2008206211115過(guò)碘酸2雪夫反應(yīng)鑒定肝細(xì)胞基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30440050、305713647)11511高碘酸氧化液配制015g高碘酸溶于
7、100ml蒸餾作者簡(jiǎn)介:劉學(xué)忠(19682),男,江蘇江都人,博士研究生,主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病與中毒病學(xué)研究。(Tel)0514287979042;水中,4℃冰箱保存。(E2mail)xmnkliu@yahoo1com1cn11512Schiff劑配制1g堿性品紅溶于200ml煮沸的蒸餾通訊作者:劉宗平,(Tel)0514287991448;(E2mail)Liuzongping@yzu1edu1cn水中,振蕩5min,冷卻至50℃過(guò)濾,并向?yàn)V液中加20ml1劉學(xué)忠等:大鼠肝細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)
8、的簡(jiǎn)易方法223mol/L的鹽酸。冷至25℃時(shí)加1g焦亞硫酸鈉(Na2S2O5)。將此液置暗處12～24h,加2g活性碳,搖動(dòng)1min過(guò)濾,保存于0～4℃,用時(shí)恢復(fù)室溫。11513PAS糖原染色取出肝細(xì)胞爬片,用019%的生理鹽水清洗2次,每次3min,70%酒精固定10min,高碘酸水溶液反應(yīng)10min,流水沖洗,蒸餾水洗5min,曬干,置入Schiff試劑中10～30min后水洗3min,自然干燥后鏡下觀察。116肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察試驗(yàn)過(guò)程中用相差倒置顯微鏡對(duì)分離純化和接種的肝細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀
