納洛酮對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用

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1、納洛酮對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用：王銀李云鴻滕鵬苗珍花楊文君李博【摘要】目的研究納洛酮(naloxone)對(duì)脂多糖(lipopolysacchar,LPS)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響。方法共培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，用LPS(1μg·mL-1)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，隨后用0.1μM納洛酮進(jìn)行干預(yù)，應(yīng)用免疫組化方法觀察計(jì)數(shù)少突膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果僅用0.1μM納洛酮處理細(xì)胞，細(xì)胞活性基本保持不變，而當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被LPS激活后，與之共培養(yǎng)的大量的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡(P<0.01);小膠質(zhì)細(xì)胞被L

2、PS激活，給予0.1μM納洛酮處理后，少突膠質(zhì)細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)。結(jié)論納洛酮能夠抑制LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞引起的少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。【關(guān)鍵詞】納洛酮;少突膠質(zhì)細(xì)胞;小膠質(zhì)細(xì)胞;LPS納洛酮又名丙烯嗎啡，為羥二氫嗎啡酮衍生物，是專一的嗎啡受體拮抗劑，與阿片受體呈立體專一性結(jié)合。納洛酮與阿片受體親和力遠(yuǎn)大于嗎啡及腦啡肽，因此納洛酮在臨床上被作為阿片類藥物中毒的治療首選藥物，用于麻醉鎮(zhèn)痛藥和非麻醉鎮(zhèn)痛藥過(guò)量、新生兒缺血缺氧性腦病等[1]。少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，在臨床

3、上與一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是新生兒相關(guān)疾病密切相關(guān)[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮核心作用。在感染因素如LPS等的刺激下，小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可釋放各種促炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。本研究通過(guò)檢測(cè)特異性抗原CD11和O4鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，觀察納洛酮對(duì)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷的抑制作用，旨在對(duì)納洛酮的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。　　1材料和方法　　1.1實(shí)驗(yàn)材料LPS、納洛酮、抗CD11抗體(小鼠IgG1mAb)、抗O4抗體(小鼠

4、IgG1mAb)購(gòu)自Sigma公司;Trans網(wǎng)篩過(guò)濾，分離的細(xì)胞種植到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)于含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。每3天換1次細(xì)胞液。2周后，利用搖床振蕩法分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，分離的小膠質(zhì)細(xì)胞種植于TransL-1PDGF和25μg·mL-1bFGF的無(wú)血清DMEM溶液。第2天，將長(zhǎng)有小膠質(zhì)細(xì)胞的Transin;PBS漂洗3次;分別加入1∶200稀釋的抗CD11單抗(CD11作為小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)、抗O4單抗(O4作為少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)

5、孵育過(guò)夜，然后再用PBS漂洗5min×3，最后加入熒光Alex-488偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)，室溫孵育1h，加入細(xì)胞核的特異性染料DAPI，孵育5min,PBS漂洗5min×3，封片，在熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞呈綠色者為陽(yáng)性細(xì)胞,應(yīng)用JEOR801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件,每片隨機(jī)取4個(gè)視野,記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),與正常對(duì)照組或LPS組細(xì)胞數(shù)相比較。　　1.2.3細(xì)胞分組與處理小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，分為4組，即對(duì)照組、LPS組、納洛酮組和LPS加納洛酮組。對(duì)照組不做任何處理

6、，LPS組用LPS(1μg·mL-1)處理4h,納洛酮組用0.1μM納洛酮處理18h,LPS加納洛酮組先用LPS(1μg·mL-1)處理4h，再用0.1μM納洛酮處理18h。處理用LPS、納洛酮均加于上層培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的Trans納洛酮處理細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目基本保持不變(預(yù)試過(guò)不同濃度納洛酮對(duì)細(xì)胞的毒性作用后選此濃度用于實(shí)驗(yàn))，而當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被LPS激活后，與之共培養(yǎng)的大量的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡(P<0.01);LPS激活后，給予0.1μM納洛酮處理后，少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目顯著升高，P<0.05(圖2A

7、、B，見(jiàn)封2)?！　?討論　　小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐細(xì)胞，行使支持、營(yíng)養(yǎng)、免疫監(jiān)視等多種功能。小膠質(zhì)細(xì)胞在受到感染、外傷等因素刺激后活化，產(chǎn)生多種免疫效應(yīng)分子，包括白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素γ、活性氮、活性氧等。這些因子介導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?nèi)缭缋闲园V呆、帕金森病等的主要因素[3-5]。體外實(shí)驗(yàn)證明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能借助NO機(jī)制使少突膠質(zhì)細(xì)胞溶解[6-8]。而少突膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)元的髓鞘形成細(xì)胞，在很多神經(jīng)性疾病中起著至關(guān)重要的作用，例如，早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化

8、的發(fā)病機(jī)制主要是由于缺血和感染導(dǎo)致腦室周圍白質(zhì)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞受損和死亡，致使腦白質(zhì)內(nèi)髓鞘不能形成，臨床上顯現(xiàn)腦癱和智能落后等后遺癥[9-10];多發(fā)性硬化癥是一種慢性、炎癥性、脫髓鞘的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,少突膠質(zhì)細(xì)胞受損和死亡，逐漸造成大腦和脊髓的斑塊性神經(jīng)髓鞘的破壞(脫髓鞘)，髓鞘的瘢痕形成影響神經(jīng)軸突的信號(hào)傳遞，以失去大腦和脊髓對(duì)外周的控制，以至多部位的僵硬或喪失功能[11-12]。　　由于在炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)退行性變中，小